纖溶酶原激活物抑制劑-1基因啟動子區(qū)4G／5G多態(tài)性與胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系

蔡 芬，曾小菁（廣東省廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗科 510800）

目前相關(guān)研究認(rèn)為惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移與纖溶活力密切相關(guān)［1-2］。纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）具有多種生物學(xué)功能，參與細(xì)胞的遷移、黏附及侵襲過程，人類PAI-1基因定位于7q21.3-7q22，PAI-1基因有8處不同的多態(tài)位點。4G／5G缺失／插入多態(tài)性是指在PAI-1基因5′端啟動子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始位點上游-675bp處存在一種單核苷酸G插入或缺失，從而基因型表現(xiàn)為3種多態(tài)性：4G／4G、4G／5G、5G／5G，在調(diào)節(jié)PAI-1基因表達(dá)過程中起了重要作用。既往研究多關(guān)注PAI-1在某種腫瘤的變化，而很少涉及PAI-1基因多態(tài)性在腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲中的作用。本研究分析胃癌患者癌變胃組織和癌旁正常胃組織PAI-1基因啟動子區(qū)4G／5G基因分布頻率，分析以上各項指標(biāo)與胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為臨床判斷預(yù)后、指導(dǎo)治療提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料隨機(jī)選取2009年4月至2010年2月本院胃腸外科初診為胃癌擬手術(shù)治療的患者28例，其中男12例，女16例，年齡26～79歲。臨床病理分期［國際抗癌聯(lián)盟（UICC）2005年公布的胃癌TNM分期法］：其中Ⅰ期4例，Ⅱ期6例，Ⅲ期16例，Ⅳ期2例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，其中Ⅱ期2例，Ⅲ期15例，Ⅳ期2例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9例。以上患者術(shù)前均未接受放化療，所有病例經(jīng)手術(shù)治療后病理組織均經(jīng)病理檢查證實［3］。

1.2 主要儀器與試劑聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國Sigma公司），電泳儀（AE-8130，日本ATTO公司），凝膠成像系統(tǒng)（UVP Mini，美國UVP公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 切取患者癌變胃組織和癌旁正常胃組織（距離癌變組織至少20cm以上）各約1cm×1cm冰凍保存。1.3.2 組織標(biāo)本DNA提取 將組織塊解凍，用生理鹽水洗去血污，剪取約0.5g組織，放入1.5mL離心管中，剪碎，鹽析法提取組織白細(xì)胞DNA，-20℃保存。

1.3.3 PCR引物合成 PCR擴(kuò)增引物設(shè)計參照文獻(xiàn)［4］。P1（插入型5G）：5′-GTC TGG ACA CG TGG GGG-3′，產(chǎn)物大小140bp；P2（缺失型4G）：5′-GTC TGG ACA CGT GGG GA-3′，產(chǎn)物大小139bp；P3：5′-TGC AGC CAG CCA CGT GAT TGT CTA-3′。

1.3.4 PAI-1基因的PCR擴(kuò)增 每份DNA標(biāo)本同時進(jìn)行兩個體系PCR反應(yīng)，即P1P3和P2P3反應(yīng)體系?？偡磻?yīng)體系25 μL，首先94℃預(yù)變性5min；94℃45s，62℃45s，72℃1min，30個循環(huán)；72℃延伸7min。

1.3.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳 吸取10μL PCR產(chǎn)物與2μL 10倍上樣緩沖液吹打混勻，上樣至20g／L瓊脂糖凝膠梳孔中，150V穩(wěn)壓電泳40min，根據(jù)電泳圖形鑒別基因型。在凝膠成像系統(tǒng)中成像、攝片，并判斷各樣本的基因型結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS11.5醫(yī)學(xué)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用基因計數(shù)法計算各組基因型頻率，χ2檢驗比較兩組標(biāo)本各基因型的分布差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PAI-1 4G／5G基因型分布特征胃癌患者癌變胃組織和癌旁正常胃組織基因型分布在總體研究對象中經(jīng)χ2檢驗符合Hardy-Weinberg平衡，根據(jù)χ2值查χ2界值表得出相應(yīng)的P值?？梢澡b別出3種基因型：4G／4G型只有139bp片段，4G／5G型有139bp和140bp 2個片段，5G／5G型只有140bp片段。見圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖片

2.2 胃癌患者PAI-1 3種基因型在癌變胃組織和癌旁正常胃組織的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.120，P＞0.05），見表1。

表1 胃癌患者不同胃組織基因型分布與比較［n（%）］

2.3 PAI-1三種基因型在胃癌各期表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.431，P＞0.05），見表2。

表2 胃癌組織分期與PAI-1 4G／5G基因型的分布（n）

2.4 胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與PAI-1 3種基因型分布頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且4G／4G型可能是胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險因素，見表3。

表3 胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與PAI-1 4G／5G基因型的關(guān)系［n（%）］

3 討 論

近年來，PAI-1基因多態(tài)性在腫瘤生長中所起的作用成為研究熱點。Gilabert-Estellés等［5］發(fā)現(xiàn)，PAI-1基因4G／5G分布頻率較健康人群高，且4G／4G基因型可能是子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的風(fēng)險因素。Lei等［6］發(fā)現(xiàn)，PAI-1 4G／5G插入／缺失多態(tài)性與乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)，其中5G／5G基因型乳腺癌患者預(yù)后最差，5G／5G基因型與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Lee等［7］發(fā)現(xiàn)，PAI-1 4G／5G插入／缺失多態(tài)性與乳腺癌的病理學(xué)分期和預(yù)后相關(guān)，且4G／4G基因型可能是乳腺癌發(fā)生的風(fēng)險因素，5G／5G基因型與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究結(jié)果表明，PAI-1 4G／5G插入／缺失多態(tài)性與胃癌的侵襲、TNM分期無關(guān)，而與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且4G／4G型基因可能是胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險因素。體外實驗分析發(fā)現(xiàn)，PAI-1基因啟動子活性在某些細(xì)胞因子刺激下4G等位基因比5G等位基因具有更高的轉(zhuǎn)錄活性；研究者認(rèn)為是由于4G等位基因只結(jié)合了一種轉(zhuǎn)錄激活物，而5G等位基因除了結(jié)合了這種轉(zhuǎn)錄激活物外，還在相同位點結(jié)合了一種轉(zhuǎn)錄抑制物，所以5G等位基因較4G等位基因的PAI-1轉(zhuǎn)錄活性低［8］。PAI-1基因4G／5G多態(tài)性的測定有助于胃癌患者病情判斷、臨床用藥的選擇、復(fù)發(fā)可能性的觀測和預(yù)后的判斷等。

［1］王肖澤，王繼見.胃癌轉(zhuǎn)移機(jī)制研究新進(jìn)展［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2010，39（4）：479-481.

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