淋巴結(jié)RUNX3基因甲基化與胃癌臨床病理因素的關(guān)系研究

楊國祥，杜寒松，張萬里，金 鑫，張 娟（.長江航運總醫(yī)院普外科，武漢 43000；.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心，武漢 4300；3.湖北省襄陽市中心醫(yī)院腫瘤科 440）

RUNX3通過調(diào)控細胞的凋亡而抑制正常細胞癌變，其mRNA及蛋白質(zhì)在胃癌組織中呈低表達狀態(tài)，且其表達水平與病理類型及臨床分期密切相關(guān)，可作為胃癌診斷、病情及預后評估的標志物［1-2］。但這些研究均限于手術(shù)切除后腫瘤標本的檢測，而對手術(shù)切除標本淋巴結(jié)RUNX3甲基化與臨床病理因素的關(guān)系研究較少［3］。本研究采用甲基化特異性PCR（MSP）檢測胃癌患者手術(shù)切除淋巴結(jié)RUNX3基因啟動子甲基化狀態(tài)，以探討RUNX3基因啟動子甲基化與臨床病理因素的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2010年1月至2013年1月長江航運總醫(yī)院手術(shù)治療的60例胃癌患者為研究對象，其中男36例，女24例；年齡30～75歲，平均（56.2±11.9）歲；幽門螺旋桿菌（HP）感染陽性21例，陰性39例。入選標準：（1）經(jīng)體格檢查、影像學檢查、胃鏡活檢和（或）術(shù)后病理組織學檢查確診為胃癌患者；（2）初治患者，術(shù)前未接受放療或化療。所有患者取經(jīng)病理組織學檢查證實為胃癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，保存于液氮中，用于RUNX3基因甲基化檢測。

1.2 方法根據(jù)DNA提取試劑盒說明提取胃癌患者淋巴結(jié)基因組總DNA。采用MSP法檢測RUNX3基因啟動子甲基化狀態(tài)。引物采用Methprimer（http：／／www.urogene.org／cgi-bin／methprimer／methprimer.cgi）設(shè)計，序列見表1，PCR擴增體系為25μL，循環(huán)條件為：95℃預變性10min，95℃變性1 min，65℃退火35s，72℃延伸35s，共30個循環(huán)，最后一輪72℃延伸10min。MSP產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后顯影檢測。

表1 RUNX3基因啟動子甲基化MSP引物序列

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用±s表示，計數(shù)資料進行χ2檢驗或Fisher精確概率法計算P值，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

60例胃癌患者中淋巴結(jié)RUNX3基因啟動子甲基化40例，甲基化率為66.7%。RUNX3基因啟動子甲基化率在性別、年齡、吸煙史、酗酒史、家族史、HP感染和腫瘤部位中的差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；在Lauren′s分型、組織學分級、腫瘤最大徑、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期和手術(shù)方式中的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。彌漫型、G3～G4、腫瘤最大徑大于或等于5cm、有遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期晚和姑息手術(shù)患者淋巴結(jié)RUNX3基因啟動子甲基化率顯著高于腸型、G1～G2、腫瘤最大徑小于5cm、無遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期早和根治手術(shù)患者（P＜0.05），具體結(jié)果見表2。

表2 胃癌患者RUNX3基因啟動子甲基化與臨床病理因素的關(guān)系

續(xù)表2 胃癌患者RUNX3基因啟動子甲基化與臨床病理因素的關(guān)系

3 討 論

RUNX3通過調(diào)控TGF-β通路抑制正常細胞癌變，在腫瘤的發(fā)病機制、診斷、病情和預后評估中具有重要作用。研究表明，導致RUNX3表達下降的機制包括基因突變及表觀遺傳學修飾。表觀遺傳學是不依賴于DNA序列改變的轉(zhuǎn)錄前調(diào)控方法，其中甲基化是表觀遺傳學最重要的調(diào)控機制，在越來越多的腫瘤中被發(fā)現(xiàn)呈高甲基化狀態(tài)，可作為腫瘤診斷、病情及預后評估的生物標志物，其靈敏度及特異性普遍高于目前傳統(tǒng)的標志物［4］。研究表明，RUNX3在胃癌組織中的表達低于正常組織。Osaki等［5］采用AS251多抗檢測胃癌細胞RUNX3蛋白質(zhì)表達，發(fā)現(xiàn)6種胃癌細胞株中RUNX3蛋白質(zhì)均呈低表達狀態(tài)。陳曉宇等［6］檢測RUNX3蛋白在胃癌組織中的表達，其陽性表達率低于其在癌旁組織，同時低分化胃癌組織中的陽性表達率低于高、中分化胃癌組織，認為RUNX3蛋白表達降低與胃癌分化程度有密切關(guān)系。基于基因表達法則，目前認為RUNX3基因缺失或甲基化修飾是其mRNA及蛋白質(zhì)表達下降的原因，該推測得到越來越多的研究證實［7］。本研究中，胃癌患者手術(shù)切除淋巴結(jié)中RUNX3基因啟動甲基化率為66.7%，與報道的手術(shù)切除標本RUNX3基因啟動子甲基化率基本一致，表明淋巴結(jié)與手術(shù)切除標本具有一致性。

進一步研究表明RUNX3基因啟動子甲基化與胃癌的臨床病理因素密切相關(guān)，這些因素包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期［8］，但這些研究均局限于對手術(shù)后切除腫瘤的研究。本研究中，胃癌患者手術(shù)切除淋巴結(jié)RUNX3基因啟動子甲基化率在Lauren′s分型、組織學分級、腫瘤最大徑、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期和手術(shù)方式中的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。彌漫型、G3～G4、腫瘤最大徑大于或等于5cm、有遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期晚和姑息手術(shù)患者淋巴結(jié)RUNX3基因啟動子甲基化率顯著高于腸型、G1～G2級、腫瘤最大徑小于5cm、無遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期早和根治手術(shù)患者（P＜0.05）。

綜上所述，Lauren′s分型、組織學分級、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期均是胃癌的預后影響因素，所以手術(shù)切除后淋巴結(jié)RUNX3基因啟動子甲基化可作為胃癌病情及預后評估的標志物，與手術(shù)后切除的腫瘤一樣均可為胃癌的病情及預后提供客觀證據(jù)。

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