胰高血糖素樣肽－1可改善高糖環境下人臍靜脈內皮細胞的氧化應激

王麗靜，陳麗云，劉曉紅，陳 洲，劉禮斌

2.福建醫科大學 藥學院，福州 350108

糖尿病血管并發癥是糖尿病致死致殘的主要原因，而內皮細胞功能紊亂是糖尿病心血管疾病發生的始動環節[1]。高血糖是最重要的刺激因素，大量研究表明，其作用機制與誘導機體氧化應激密切相關[2－3]。氧化應激是自由基引起的一種負面效應，其自由基主要包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）、活性氮和親電子體等。機體的抗氧化防御機制主要成分包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH－PX）等，其中SOD是抗氧化防御的第一線。

胰高糖素樣肽－1（glucagon－like peptide－1，GLP－1）是近年來糖尿病研究領域的熱點，因其可促進胰島素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌而用于糖尿病的臨床治療中。此外，研究發現GLP－1對內皮細胞功能亦有保護作用[4]，但其機制尚不清楚。本研究觀察GLP－1對高糖培養人臍靜脈內皮細胞（human umbilical veine ndothelial cells，HUVECs）功能的作用，并進一步探討其對氧化應激相關指標變化的影響，以期為更好地理解GLP－1的糖尿病心血管保護作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 臍帶標本采自福建醫科大學附屬協和醫院健康孕婦剖腹產后，立即對HUVECs進行分離培養。

1.1.2 試劑 M199培養基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司），內皮細胞生長添加劑（美國BD公司），GLP－1（7－36）（美國 Sigma公司），膠原酶Ⅰ（美國Invitrogen公司），SOD活力檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒、NO（DAF－FMDA探針法）檢測試劑盒（杭州碧云天生物技術研究所）。

1.1.3 儀器 二氧化碳培養箱（MCO－15AC，日本SANYO公司），熒光酶標儀（Thermo scientific公司），倒置顯微鏡（CKS41，日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 原代 HUVECs的分離、培養 取當天剖腹產新鮮臍帶10～15cm，洗凈臍帶表面的殘留血液，無菌手術刀片部分切除其一端，辨別臍帶靜脈，以雙抗PBS充分沖洗臍靜脈至流出液體中無血性液體，灌入0.1%膠原酶Ι在37℃條件中消化15min。消化結束后PBS沖洗臍帶，收集消化液離心后棄上清，加入4mL 10%M199培養基懸浮細胞，接種到塑料培養瓶中，37℃、體積分數為0.05的CO2恒溫培養箱中培養。每2～3d換液1次，當細胞生長融合達80%～90%時，消化、傳代接種于培養板上。

1.2.2 人臍靜脈內皮細胞鑒定 取生長良好的第三代細胞按105mL－1細胞密度接種于6孔培養板中，培養24h。以4%多聚甲醛中固定，PBS清洗后加入0.5%Triton X－100破膜處理，加入3%H2O2室溫浸泡20min；5%BSA封閉20min。滴加兔抗人Ⅷ因子抗體，置于濕盒中4℃過夜。滴加山羊抗兔二抗（HRP標記），37℃孵育20min。將DAB顯色劑混勻后加至爬片，室溫避光顯色，當胞質中出現棕褐色顆粒時終止顯色，蒸餾水沖洗干凈。蘇木素精復染2min。脫水，透明，封片，顯微鏡觀察拍照。

1.2.3 實驗分組 將 HUVECs細胞分為：對照組，不做任何處理；高糖組，30mmol／L D－葡萄糖培養；GLP－1預處理組，先加入GLP－1 100nmol／L預處理1h，后以30mmol／L D－葡萄糖培養7d。

1.2.4 乳酸脫氫酶釋放檢測細胞毒性定量分析細胞按1.2.3實驗組別進行分組干預。干預結束后，取細胞上清液。將120μL待檢樣本及60mL LDH檢測工作液（乳酸溶液、INT溶液、酶溶液按1∶1∶1）混勻，室溫孵育30min；酶標儀下測定吸光度（使用490nm和620nm雙波長測定）；按公式：

計算評價細胞毒性情況。

1.2.5 熒光酶標儀檢測ROS水平 細胞按1.2.3實驗組別進行分組干預；各組加入適量DCFH－DA 10μmmol／L于培養基中，37℃避光孵育30min。加入胰酶消化后制備細胞懸液。細胞計數后每組取等數量的細胞，用PBS重懸細胞沉淀，按200μL／孔加樣于96孔黑色檢測板中；熒光酶標儀（激發波長500nm、發射波長525nm）下檢測各組熒光強度。

1.2.6 黃嘌呤氧化酶法測定細胞內SOD活性 細胞按1.2.3實驗組別進行分組干預，細胞刮刀刮下各組細胞，PBS清洗后4℃離心（2 000g，10min）分別收集細胞沉淀；收集細胞沉淀以超聲破碎，向各孔加入反應物，37℃孵育20min，酶標儀（450nm處）檢測OD值。SOD抑制率及活性的計算公式如下：

1.3 統計學處理 結果以±s表示，采用SPSS 11.5軟件處理數據。多組間比較采用單因素方差分析（One－way ANOVA）或秩和檢驗，以P＜0.05為差別有統計學意義。

2 結 果

2.1 HUVECs培養及鑒定 原代內皮細胞培養3h后開始貼壁，24h完全貼壁，早期貼壁細胞呈短梭形，細胞多成團生長，少數細胞分散生長；5～7d細胞單層鋪滿呈鋪路石樣生長（圖1A）。內皮細胞FⅧ抗原相關染色鑒定，FⅧ是由因子FⅧ促凝成分（FⅧ∶C）和內皮細胞合成的vWF（von Willebrand factor）組成的一種復合物，內皮細胞鑒定即是通過觀察FⅧ因子免疫組織化學染色完成，FⅧ抗原陽性細胞表現為胞漿中可見染成棕褐色的顆粒，即為HUVECs（圖1B）。

圖1 原代HUVECs培養及鑒定Fig 1 Culture and identification of HUVECs

2.2 GLP－1可降低高糖環境對HUVECs的毒性作用 以各處理組細胞上清中LDH漏出量與對照組細胞上清中LDH漏出量的百分比值評價細胞毒作用，結果表明30mmol／L葡萄糖作用7d對細胞有明顯的毒性作用（圖2），高糖組LDH漏出量為對照組的（181.07±3.35）%，GLP－1預處理組 LDH漏出量為對照組的（134.94±1.78）%（vs對照組，P＜0.01），比高糖組降低了46.13%（vs高糖組P＜0.01）。

2.3 GLP－1可降低高糖誘導 HUVECs產生的ROS水平 與對照組比較，單獨高糖處理4d即可使HUVECs細胞內ROS產生增多近60%[（224.85±4.73）vs（141.80±3.79），P＜0.01]；7d則可使細胞內ROS增加1倍以上[（300.00±4.73）vs（137.58±7.37），P＜0.01]。選取高糖作用7d誘導內皮細胞損傷模型，同時行GLP－1預處理聯合高糖共同作用，觀察GLP－1對高糖下內皮細胞的保護作用。GLP－1預處理組細胞內ROS水平強度比單獨高糖處理組降低了46.18%[（156.68±9.40）vs（291.14±12.21），P＜0.01]（圖3）。

圖2 胰高糖素樣肽－1可降低高糖環境對人臍靜脈內皮細胞的毒性Fig 2 GLP－1could reduce toxicity of high glucose in HUVECs

圖3 胰高糖素樣肽－1可降低高糖誘導人臍靜脈內皮細胞產生的細胞內活性氧自由基水平Fig 3 GLP－1could decrease high glucoseinduced ROS in HUVECs

2.4 GLP－1可提高高糖環境下HUVECs細胞內SOD活力 與對照組比較，單獨高糖處理7d組細胞內 SOD 酶活性無明顯改變 [（23.81±1.41）vs（22.48±2.19）U／mgprot，P＞0.05]；GLP－1 預處理組SOD酶活性比單獨高糖處理組升高了64.64%[（22.48±2.19）vs（39.20±2.21）U／mgprot，P＜0.01]（圖4）。

圖4 胰高糖素樣肽－1提高高糖環境下人臍靜脈內皮細胞細胞內超氧化物歧化酶活力Fig 4 GLP－1could increase the activity of SOD in HUVECs in high glucose

3 討 論

在針對糖尿病心血管病變分子機制的研究中發現，高糖誘導內皮細胞功能紊亂是通過氧化應激實現的[6]。高糖通過非酶糖基化形成糖基化終末產物（advanced glycationend products AGES）、激活多元醇途徑等生成大量ROS[7]。機體的抗氧化防御機制包括兩大系統：清除各種活性氧和自由基的酶性抗氧化系統和非酶性抗氧化劑。酶性抗氧化系統主要包括SOD、GSH－PX和過氧化氫酶等。SOD是金屬酶，能催化超氧陰離子的歧化反應，是抗氧化防御的第一線。過多的ROS超過機體抗氧化能力時消耗NO，導致血管舒張功能障礙，同時發揮細胞毒性損傷作用，誘導內皮細胞凋亡，破壞內膜完整性從而促發動脈粥樣硬化進程。

GLP－1及其類似物作為一類新的降糖藥物已成功地應用于2型糖尿病的治療。它通過葡萄糖依賴性地作用于胰島β細胞促進胰島素的合成和分泌；抑制餐后胃排空、抑制食欲及促進肝臟、肌肉、脂肪組織糖原合成增多等機制來降低血糖。在針對其臨床應用的薈萃分析中提示GLP－1還具有獨立于上述作用之外的潛在的心血管保護作用[8]：可以改善內皮功能、促進心肌葡萄糖攝取、增加左室心功能和射血分數等。Nystrom等觀察到GLP－1可以增加內皮依賴的血管舒張程度，提示其具有內皮細胞保護作用[9]。Younce等認為GLP－1發揮抗凋亡的作用與其抑制其內質網應激有關[10]。但尚缺乏足夠的基礎研究方面的依據。

本實驗通過檢測ROS、SOD活力等指標闡明細胞氧化應激狀態與抗氧化能力。文獻報道，利用高糖或其生成的AGES均可誘導內皮細胞ROS的升高，導致其功能障礙[11－12]。本研究在觀察高糖培養HUVECs過程中，培養液中LDH的含量升高了1.8倍，證實了高糖對內皮細胞的毒性作用。同時觀察到高糖培養4d開始細胞內ROS明顯升高，7d ROS成倍升高，而細胞內SOD活力與對照組比較，差別無統計學意義，證實高糖可使內皮細胞ROS不斷積聚，最終超出抗氧化系統的清除能力，導致細胞氧化應激狀態，發揮細胞毒性損傷作用，研究結果與以往的文獻報道一致。而在本課題組的前期研究中也證實了氧化劑第三丁基過氧化氫（t－BHP）可以誘導內皮細胞氧化損傷，使細胞一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）蛋白表達增加，胞內 NO 水平增高[13]。

大量動物實驗表明，通過添加抗氧化劑或過表達SOD或過氧化氫酶能夠預防組織細胞的病變，間接證明了ROS在糖尿病并發癥的發生中起著重要作用。Yao等認為AGES誘導細胞功能障礙的關鍵機制是高糖誘導的氧化應激[14]，長期的高糖刺激下調乙二醛酶－1活性及基因蛋白表達，在過表達SOD基因后，乙二醛酶－1活性及表達得到恢復，AGES減少。本實驗中，與單獨高糖組比較，GLP－1干預后培養液中LDH的含量降低了46.13%，提示GLP－1可以減輕高糖對內皮細胞的毒性作用，同時伴隨著細胞內ROS降低，SOD活力升高。Ding等研究發現，GLP－1可以激活eNOS的活性，促進eNOS磷酸化，上調eNOS蛋白表達[15]。Shiraki等發現，GLP－1類似物利拉魯肽可以抑制腫瘤壞死因子誘導的HUVECs的ROS產生[16]，同時可以增加SOD、過氧化氫酶、GSH－PX等抗氧化酶的合成。以上均提示GLP－1可能是通過上調細胞內氧化防御系統的活性，減輕氧化應激，提高內皮細胞抗凋亡能力，改善內皮細胞功能。但對于GLP－1改善內皮細胞功能的具體信號機制還需要進一步研究。

綜上所述，GLP－1可以改善高糖對 HUVECs的細胞毒性作用，保護高糖誘導的血管內皮細胞功能障礙，機制可能是通過減輕細胞氧化應激來實現的。研究結果將為臨床應用GLP－1及其類似物治療2型糖尿病、改善患者的心血管功能和減少心血管并發癥提供實驗依據。

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