超聲波提取米團(tuán)花多糖*

楊婷婷，張廣文，朱玲玲，歐仕益

(暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632)

米團(tuán)花(Leucosceptrum canum Smith)別名山蜂蜜、漬糖樹、羊巴巴、蜜蜂樹花、明堂花，主要分布在我國的滇中至滇南地帶，生長在海拔400～1 900 m的林緣、水邊和路邊草地，是一種蜜源植物，在云南一直被人們作為天然的食用原料添加到食物中［1］。近些年研究表明植物多糖具有抗氧化、抗炎、抗癌、增強(qiáng)免疫力等多種生理功能，因此植物多糖的研究受到了人們的普遍關(guān)注［2-4］。但關(guān)于米團(tuán)花多糖的研究鮮有報(bào)道，對米團(tuán)花多糖進(jìn)行研究不僅能擴(kuò)大植物多糖的來源，還為開發(fā)其潛在的藥用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值提供理論依據(jù)。

傳統(tǒng)的多糖提取方法主要是加熱或煮沸法，不僅效率低而且耗時(shí)長。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，超聲波提取、微波提取以及超臨界萃取等新型提取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于活性物質(zhì)的提取，而超聲波提取技術(shù)因其在植物多糖提取中的眾多優(yōu)點(diǎn)更是被廣泛采用［5-8］。本實(shí)驗(yàn)對米團(tuán)花多糖的提取工藝進(jìn)行了研究，采用超聲波輔助提取技術(shù)，考察了超聲功率、料液比、以及超聲時(shí)間對米團(tuán)花多糖得率的影響。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以米團(tuán)花多糖得率為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法(response surface methodology，RSM)對超聲波提取米團(tuán)花多糖工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，該設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案不僅實(shí)驗(yàn)周期短，而且具有求得回歸方程精度高的優(yōu)點(diǎn)［9-10］。并采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系以獲得最優(yōu)工藝參數(shù)，從而提高了米團(tuán)花多糖得率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米團(tuán)花，購于云南省寶山市，依次在65℃烘箱中經(jīng)24 h烘干后，粉碎，過45目篩，置于干燥器中儲(chǔ)存?zhèn)溆?苯酚、無水乙醇、石油醚，分析純，天津市富起化工有限公司;三氯甲烷、正丁醇、丙酮，分析純，廣州化學(xué)試劑廠;考馬斯亮藍(lán)、濃H2SO4、葡萄糖，分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

透析袋(齊云生物技術(shù)有限公司);HH-4型恒溫水浴鍋(江蘇金壇市宏華儀器廠);RE-552 AAB型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海嘉鵬科技股份有限公司);MP502B型電子分析天平(上海精密科技儀器有限公司);722S型可見分光光度計(jì)(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);GZX-DH.500-S-Ⅱ型電熱恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);高速萬能粉碎機(jī)(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);THC型數(shù)控超聲波提取機(jī)(濟(jì)寧天華超聲電子儀器有限公司);冷凍干燥機(jī)(寧波生化儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超聲波提取米團(tuán)花多糖

精確稱取5.0 g米團(tuán)花粉末于250 mL圓底燒瓶中，依次用石油醚、丙酮回流脫脂后，在恒定的溫度下，按一定的料液比例加入適量蒸餾水，混勻后充分浸透，然后置于超聲波儀器內(nèi)，以一定功率提取一段時(shí)間，抽濾提取液，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，加入4倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇于4℃下醇沉24 h，5 000 r/min離心5 min。取沉淀，加蒸餾水復(fù)溶，采用Sevage［V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1 ］法脫蛋白，按照一定比例取粗多糖溶液和Sevage溶液(體積比4∶1)于20 mL試管中，渦旋5 min，使其充分反應(yīng)，取其上清液，重復(fù)操作3次［11-12］，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白脫除率。上清液依次于4℃條件下透析2 d后用4倍體積無水乙醇醇沉，10 000 r/min離心5 min，取其沉淀冷凍干燥得米團(tuán)花多糖樣品。

以水作溶劑進(jìn)行提取，按照上述操作，在恒定溫度條件下分別考察超聲功率(300～700 W)、料液比［1∶10 ～1∶50(g∶mL)］、超聲時(shí)間(30 ～70 min)對米團(tuán)花多糖得率的影響。

1.2.2 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法［13］。以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)，在490 nm處測定葡萄糖濃度與吸光度的對應(yīng)關(guān)系，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=1.070 7x+0.037 7，R2=0.999 2。精確稱取米團(tuán)花多糖樣品10.0 mg，水溶解后定容到10 mL，搖勻，作為多糖儲(chǔ)備液。精確吸取多糖儲(chǔ)備液0.2 mL，加水至2 mL，按測定標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法測其吸光值。

1.2.3 多糖得率

多糖得率/%=(多糖含量/米團(tuán)花原料質(zhì)量)×100。

米團(tuán)花多糖含量與多糖得率呈正相關(guān)，多糖得率即反映了多糖含量，因此采用多糖得率數(shù)據(jù)為依據(jù)來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論。

1.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合前期單因素試驗(yàn)的結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在恒定的溫度條件下以超聲功率、料液比、超聲時(shí)間3個(gè)因素為自變量，米團(tuán)花多糖得率為響應(yīng)值，進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并采用響應(yīng)面分析法在3因素3水平上對提取過程進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素與水平見表1。

1.4 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

精確稱取3組米團(tuán)花多糖樣品各1.0 g，按最佳提取工藝條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算多糖得率。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)脫除率

如圖1所示，經(jīng)過Sevage法脫蛋白，米團(tuán)花提取液中的蛋白脫除率隨著脫除次數(shù)的增加而增大，在第3次時(shí)達(dá)到了92.14%，隨后增加脫除次數(shù)，脫除率并沒有明顯的變化。因此以脫除3次為最佳脫除次數(shù)。

圖1 蛋白脫除率Fig.1 The removal rate of protein

2.2 超聲波提取米團(tuán)花多糖單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 超聲功率對米團(tuán)花多糖得率影響

在料液比 1∶30(g∶mL)，提取時(shí)間 50 min，分別考察超聲功率300、400、500、600、700 W 對米團(tuán)花多糖得率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2所知，隨著超聲功率的增大，米團(tuán)花多糖得率也逐漸的提高，在500 W時(shí)多糖得率達(dá)到最大值為17.48%;超聲功率大于500 W時(shí)多糖得率反而降低，這主要是由于超聲波功率增大機(jī)械作用越強(qiáng)，分子擴(kuò)散越快多糖就容易溶出，而超聲功率大于500 W時(shí)機(jī)械作用和空化作用過強(qiáng)而造成多糖降解為寡糖，引起多糖得率的降低。

圖2 超聲功率對多糖得率影響Fig 2 The influence of ultrasonic power on polysaccharide yield

2.2.2 料液比對米團(tuán)花多糖得率影響

在超聲時(shí)間50 min，超聲功率500 W，分別考察料液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)對米團(tuán)花多糖的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出，在料液比為1∶10 ～1∶30(g∶mL)時(shí)，隨著料液比的增加，多糖得率從12.32%增加到17.56%。這是因?yàn)榱弦罕鹊脑黾蛹哟罅巳軇┡c米團(tuán)花的接觸面積從而使多糖更易溶出;當(dāng)料液比為1∶30～1∶50(g∶mL)時(shí)，多糖得率從17.56%降低到16.62%。過多的溶劑不僅造成多糖得率降低，而且也造成溶劑的浪費(fèi)，增大生產(chǎn)成本，所以選擇最佳料液比為1∶30(g∶mL)。

圖3 料液比對多糖得率影響Fig.3 The influence of solid-liquid ratio on polysaccharide yield

2.2.3 超聲時(shí)間對米團(tuán)花多糖得率的影響

在超聲功率500 W，料液比1∶30(g∶mL)條件下，分別考察超聲時(shí)間 30、40、50、60、70 min 對米團(tuán)花多糖得率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看出，在米團(tuán)花多糖得率在50 min前隨著提取時(shí)間的增加而增加，之后隨著時(shí)間的增加多糖得率反而降低。造成這一現(xiàn)象的原因可能是隨著超聲時(shí)間的增加，細(xì)胞遭到破壞多糖的溶出率增加;超聲時(shí)間超過50 min多糖得率降低，一方面是溶劑體系已經(jīng)達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡，另一方面可能是超聲時(shí)間過長致使多糖發(fā)生分解所致。因此，選擇最佳超聲時(shí)間為50 min，米團(tuán)花多糖得率為17.32%。

圖4 超聲時(shí)間對多糖得率的影響Fig 4 The influence of ultrasonic time on polysaccharide yield

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

依據(jù)軟件Box-Behnken試驗(yàn)方案進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)，結(jié)果見表2。將所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到以多糖得率(Y)為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程:

Y=17.500 00+0.258 75A+0.206 25B+0.272 50C+0.075 000AB-0.297 50AC+0.012 500BC-0.260 00A2-0.090 000B2-0.252 50C2.

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experiment design and results of Box-Behnken

2.4 回歸方程方差分析

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for regression equation

表3可知，回歸模型的P＜0.000 1，說明該模型極顯著，其響應(yīng)值與各試驗(yàn)因素之間存在顯著的線性相關(guān)性。模型R2=0.982 9，R2Adj=0.960 8，兩者數(shù)值極為相近，說明該模型能反映96.08%響應(yīng)值的變化，因而該模型擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)誤差小CV=0.43%較低，說明實(shí)驗(yàn)操作可信。同時(shí)失擬項(xiàng)也進(jìn)一步表明回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，綜上可以確定回歸方程為米團(tuán)花多糖超聲波提取工藝的優(yōu)化提供了一個(gè)合適的模型。

從對各因素的方差分析中可以看出超聲功率A、料液比B、超聲時(shí)間C的P值均≤0.000 1，說明了A，B，C對米團(tuán)花多糖得率有顯著性影響，根據(jù)它們的F值可以判斷，對多糖得率的影響順序從大到小依次為:C＞A＞B。交互項(xiàng)AC的 P值小于0.001，說明AC的交互作用對米團(tuán)花多糖得率具有顯著性影響，而AB，BC對多糖得率的影響均不顯著。二次項(xiàng)A2，C2的P值小于0.001，對米團(tuán)花多糖的得率具有顯著性影響，且A2對多糖得率的影響大于C2。而B2對多糖得率影響不顯著。

2.5 超聲波提取米團(tuán)花多糖工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

由圖5可知，AC交互影響顯著，多糖得率隨著超聲功率和超聲時(shí)間的增加而迅速增大。較低超聲功率時(shí)，隨著提取時(shí)間的增加，多糖得率呈緩慢上升趨勢;增大超聲功率，隨著時(shí)間延長多糖得率呈較大上升趨勢，且趨勢明顯，并且在功率為500 W，時(shí)間為50 min時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值。圖6可知，BC的交互影響不顯著，隨著料液比的變化，多糖得率有較小的上升趨勢，料液比一定，多糖得率隨提取的時(shí)間的延長而相應(yīng)增大;而時(shí)間一定時(shí)，料液比的增加對多糖得率影響較小。圖7可知，AB的交互影響一般顯著，料液比一定時(shí)，超聲功率對多糖影響率較大，隨著超聲功率的增大多糖得率呈先增后降的趨勢。3個(gè)因素對多糖得率的影響以及各因素之間的交互影響與回歸分析結(jié)果相吻合。

從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等高線可以看出在所選的范圍內(nèi)存在極值，響應(yīng)面的最高點(diǎn)同時(shí)也是等值線中的最小橢圓的中心點(diǎn)。通過嶺嵴分析得到米團(tuán)花多糖最佳超聲波提取工藝條件為:超聲功率548.3 W，料液比1∶30(g∶mL)，提取時(shí)間 55.6 min，理論最佳提取率為17.74%。根據(jù)實(shí)際情況按照料液比1∶30(g∶mL)，超聲功率548 W，提取時(shí)間55 min進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到米團(tuán)花多糖的提取率為17.59%，與預(yù)測值較為接近，擬合性好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分驗(yàn)證了所建模型的正確性，說明響應(yīng)面法適用于超聲波提取米團(tuán)花多糖工藝條件的回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

圖5 Y=f(A、C)的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour of Y=f(A、C)

圖6 Y=f(B、C)的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour of Y=f(B、C)

圖7 Y=f(A、B)的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour of Y=f(A、B)

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立了影響米團(tuán)花多糖得率二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，并應(yīng)用響應(yīng)面分析法對影響超聲波提取米團(tuán)花多糖的主要因素(超聲功率、料液比、超聲時(shí)間)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，超聲波提取米團(tuán)花多糖的最佳工藝條件為:超聲功率548.3 W，料液比1∶30(g∶mL)，提取時(shí)間為55.6 min。在此條件下，實(shí)際提取率17.59%，與模型理論預(yù)測值17.74%的相對誤差為0.8%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，利用響應(yīng)面法對超聲波提取米團(tuán)花多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化，可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，為米團(tuán)花多糖的進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)的熱水提取米團(tuán)花多糖實(shí)驗(yàn)。在一定溫度下按料液比1∶30(g∶mL)，時(shí)間為55.6 min進(jìn)行提取，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次。在此條件下，米團(tuán)花多糖提取率為12.38%，這與在超聲條件下多糖得率17.59%有著較大差距，因此超聲波提取米團(tuán)花多糖與傳統(tǒng)的熱水提取相比較具有較為明顯的優(yōu)勢。

［1］ 吳清林，梁濤，張廣文，等.米團(tuán)花色素提取前后的主要成分變化分析［J］.食品研究與發(fā)展，2012，33(1):113-115.

［2］ Souza B W S，Cerqueira M A，Bourbon A I，et.al.Chemical characterization and antioxidant activity of sulfated polysaccharide from the red seaweed Gracilaria birdiae ［J］.Food Hydrocolloid，2012，27(2):287-292.

［3］ CHEN H X，ZHANG M，QU Z S，et.al.Antioxidant activities of different fractions of polysacchari-de conjugates from green tea(camellia sinensis)［J］.Food Chem，2008，106(2):559-563.

［4］ XIONG S L，LI A L，HUANG N，et.al.Antioxidant and immunoregulatory activity of different polysaccharide fractions from tuber of phiopogon japonicus［J］.Carbohydr.Polym，2011，86(3):1 273-1 280.

［5］ 沈霞，張艷，袁慧慧，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化艾葉粗多糖提取工藝的研究［J］.中成藥，2010，32(1):48-51.

［6］ 汪顯陽，姚春艷，張佩文，等.六味地黃丸中多糖含量測定研究［J］.中醫(yī)藥研究，2000，16(4):42-44.

［7］ 王洪偉，崔崇士，徐雅琴.南瓜多糖復(fù)合酶法提取及純化的研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(8):247-249.

［8］ 趙昱，朱剛，于長青，等.超臨界CO2萃取當(dāng)歸油的工藝及當(dāng)歸多糖的提取［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，6(11):512-513.

［9］ 戴喜末，熊子文，羅麗萍.響應(yīng)面法優(yōu)化野艾蒿多糖的超聲波提取及其抗氧化性研究［J］.食品科學(xué)，2011，32(8):93-97.

［10］ 張琳，樊金玲，朱文學(xué)，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取甘草多糖工藝［J］.食品科學(xué)，2010，31(16):67-71.

［11］ 唐志紅，于志超，趙巍，等.滸苔多糖超聲波提取工藝的研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2011，27(1):56-59.

［12］ 曹楠楠，陳香榮，吳艷.苦豆子多糖的超聲波提取工藝優(yōu)化及理化性質(zhì)研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2014，30(2):209-215.

［13］ Saha S K，Brewer E F.Determination of the concentrations of oligosaccharides，complex type carbohydr-ates and glycoproteins using the phenol-sulfuric acid method［J］.Carbohyd Res，1994，254:175-181.