17β-雌二醇對H2O2致血管內皮損傷的保護作用及機制的研究

王朝霞，趙 燁，范春雨，呂吉元

17β-雌二醇對H2O2致血管內皮損傷的保護作用及機制的研究

王朝霞，趙 燁，范春雨，呂吉元

目的 探討17β-雌二醇對H2O2引起的血管內皮損傷的保護作用和可能的機制。方法 人臍靜脈內皮細胞株在37 ℃、5%CO2，條件下正常培養至細胞形成致密單層時，分別進行干預。實驗分為5組，空白對照組：細胞正常培養，含10%胎牛血清DMEM培養基培養；過氧化氫損傷組：將培養融合狀態達到80%～90%的HUVEC，每孔加入終濃度為0.75 mmol/L的H2O2；H2O2損傷+17β-雌二醇保護組：H2O2損傷濃度同過氧化氫損傷組，17β-雌二醇終濃度0.1 mmol/L；單純17β-雌二醇組：17β-雌二醇終濃度0.1 mmol/L；H2O2損傷+17β-雌二醇保護+渥曼青霉素組 H2O2損傷濃度同過氧化氫損傷組，17β-雌二醇終濃度0.1 mmol/L，渥曼青霉素終濃度100 nmol/L。收集干預后的各組細胞，Western-blot法檢測細胞內PI3K/Akt蛋白表達情況，用CCK-8法比較細胞活性，流式細胞技術測定細胞凋亡率，熒光探針標記法測定細胞內活性氧(ROS)水平。結果 17β-雌二醇可以明顯提高氧化應激損傷組內皮細胞中PI3K/Akt的表達，17β-雌二醇可以明顯提高H2O2損傷后血管內皮細胞的存活率，降低早期和晚期凋亡率，并且減少H2O2損傷后血管內皮細胞內的ROS含量，差異有統計學意義(P<0.001)，在加入PI3K/Akt通路的特異性抑制劑渥曼青霉素以后，17β-雌二醇抗氧化損傷的作用明顯減弱。結論 17β-雌二醇通過上調H2O2導致的血管內皮細胞損傷后胞內PI3K/Akt蛋白的表達，提高細胞存活率，發揮抗氧化損傷和抗細胞凋亡作用，這可能是雌激素發揮心血管保護效應的重要途徑之一。

血管內皮損傷；17β-雌二醇；氧化應激； PI3K/Akt信號通路

中國的女性死因排序中，心血管疾病死亡率已超過了腦卒中和腫瘤，成為首位死亡原因。血管內皮細胞受損是動脈粥樣硬化的始動環節，也是很多心血管疾病的病理基礎。近年來活性氧自由基對血管內皮的損傷作用已引起人們的廣泛重視，在一些損傷因素的作用下，細胞內氧化代謝物增加，或細胞中抗氧化保護機制不足時，使活性氧(ROS)產生堆積并對細胞產生毒性，這種氧化和抗氧化的不平衡狀態稱之為氧化應激。活性氧可以導致內皮細胞受損凋亡，保護內皮細胞和防止其凋亡，對防止心血管疾病具有重要的意義。雌激素(estorgen，E)具有保護女性心血管系統、防止和延緩動脈粥樣硬化形成以及提高女性冠狀動脈硬化性心臟病(coronary heart disease，CHD)患者生存率和生活質量的作用，絕經后的婦女接受雌激素替代療法能降低患冠心病的風險達40%～50%[1，2]，使女性死亡率下降89%[3]。血管內皮損傷是引發動脈粥樣硬化和血管再狹窄的重要原因[4]，已有研究提示17β-雌二醇可明顯縮小球囊損傷術后的內皮損傷面積[5]，抑制內皮細胞凋亡[6]。

近年研究認為，雌激素對血管內皮的保護作用可能來自兩個方面：一是促進血管內皮功能恢復，二是促進血管內皮損傷修復[5]，但作用機制不清。雖然雌激素在心血管領域的研究不少，但雌激素對血管內皮的損傷后保護作用機制目前研究尚不完全清楚，本研究旨在探討雌激素對過氧化氫引起的內皮損傷的保護作用和可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)購自北京協和醫科大學細胞中心，Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)、胰蛋白酶為美國GIBCO公司產品，17β-雌二醇購自美國Sigma公司，CCK-8購自碧云天試劑公司，小牛血清購自Hyclone公司，渥曼青霉素購自Alexis公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人臍靜脈內皮細胞采用含10%的胎牛血清的DMEM培養基培養，置入37 ℃，5%CO2細胞培養箱內，所有實驗檢測于培養3 d～4 d細胞達80%～90%融合狀態后進行。

1.2.2 實驗分組 空白對照組：細胞正常培養，含10%胎牛血清DMEM培養基培養；過氧化氫損傷組：將培養融合狀態達到80%～90%的HUVEC，每孔加入終濃度為0.75 mmol/L的H2O2；H2O2損傷+17β-雌二醇保護組：H2O2損傷濃度同過氧化氫損傷組，17β-雌二醇終濃度0.1 mmol/L；單純17β-雌二醇組：17β-雌二醇終濃度0.1 mmol/L； H2O2損傷+17β-雌二醇保護+渥曼青霉素組：H2O2損傷濃度同過氧化氫損傷組，17β-雌二醇終濃度0.1 mmol/L，渥曼青霉素終濃度100 nmol/L。

1.2.3 Western-blot檢測細胞中PI3K/Akt蛋白含量變化 不同干預后，檢測各組PI3K/Akt蛋白的含量，按照試劑盒操作說明逐步操作，提取細胞蛋白并進行濃度測定，進行SDS-PAGE電泳和轉膜、免疫反應和曝光，利用Quantity one 圖像分析軟件分析實驗結果。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞活性 細胞接種于96孔板，無血清培養24 h后，棄無血清培養液，暴露于含H2O2的培養液，繼續培養12 h；17β-雌二醇與渥曼青霉素在暴露前6 h加入。培養結束，培養液中按1∶10比例加入CCK-8液，37 ℃孵箱繼續孵育1 h，酶標儀450 nm處檢查每孔的吸光度OD值。細胞存活率(%)=處理組OD值/對照組OD組×100%。

1.2.5 Annexin-V/PI聯合染色流式細胞術檢測細胞凋亡率 細胞接種于6孔板，不同處理后，棄培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍，0.25%胰蛋白酶消化1 min，含胎牛血清的培養液終止消化，移入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加Annexin-V/PI液，避光孵育20 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 流式細胞術檢測HUVEC內ROS含量 細胞按1×105/mL密度接種于6孔板，每孔1 mL。收集各組細胞，去除培養基，各孔加入1 mL濃度為10 μmol/L的DCFH-DA探針，繼續孵育20 min，然后用無血清培養液洗滌3次，PBS液洗滌1次，0.25%胰蛋白酶500 mL消化2 min，冰浴終止消化，移入離心管，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入適量Barfer，上流式細胞儀檢測細胞內ROS的量。

1.2.7 熒光探針標記法測定HUVEC內ROS活性 具體探針標記方法同上，用無血清培養液及PBS也洗滌以后，熒光顯微鏡下觀察細胞內ROS表達情況。

2 結 果

2.1 Western-blot檢測細胞中PI3K/Akt蛋白含量變化 H2O2損傷引起的氧化應激可以刺激細胞中PI3K/Akt蛋白表達輕度上調，從而發揮抗氧化作用，與空白對照組相比，H2O2損傷組PI3K表達0.540±0.033、0.570±0.039，差異無統計學意義，Akt表達差異有統計學意義(0.560±0.038 vs 0.310±0.011，P<0.05)。H2O2損傷在有17β-雌二醇保護劑條件下，細胞內抗氧化相關通路蛋白PI3K、Akt表達明顯升高(0.850±0.046、0.740±0.042，P<0.001)。詳見圖1。

注：A為空白對照組；B為H2O2損傷組；C為H2O2損傷+17β-雌二醇保護組；D為17β-雌二醇組。H2O2損傷組與對照組、17β-雌二醇保護組、17β-雌二醇保護+渥曼青霉素組比較，P<0.001。

圖1 Western-blot檢測細胞中PI3K/Akt蛋白含量變化

2.2 CCK-8檢測細胞存活率 17β-雌二醇可以明顯減少氧化應激引起的細胞凋亡，增加細胞存活率(見圖2)。加入CCK-8試劑后，培養孔中活細胞數越多，對應的450 nm處吸光度值越高。實驗表明，不同干預組細胞的存活率不同，氧化應激損傷組細胞存活率最低，細胞活性為對照組的(30.95±1.95)%，氧化應激損傷組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.001)。加入17β-雌二醇，可以明顯減少氧化應激引起的細胞損傷死亡，細胞存活率明顯提高為對照組的(72.63±3.51)%，H2O2+17β-雌二醇組與對照組比較差異有統計學意義(P<0.001)，而H2O2+17β-雌二醇組加入PI3K/Akt抑制劑渥曼青霉素細胞存活率又有所下降，為(42.50±2.28)%。H2O2損傷組與H2O2加17β-雌二醇組比較差異有統計學意義(P<0.001)，H2O2損傷組與H2O2+17β-雌二醇+渥曼青霉素組比較差異有統計學意義(P<0.001)，H2O2+17β-雌二醇組與H2O2+17β-雌二醇+渥曼青霉素組的差異有統計學意義(P<0.001)。

注：A為空白對照組；B為H2O2損傷組；C為H2O2損傷+17β-雌二醇保護組；D為17β-雌二醇組；E為H2O2損傷+17β-雌二醇保護+渥曼青霉素組。H2O2損傷組與對照組、17β-雌二醇保護組、17β-雌二醇保護+渥曼青霉素相比較，P<0.001。

圖2 CCK-8法檢測各組細胞活性的結果

2.3 流式細胞術細胞凋亡率檢測結果 流式細胞術檢測的各不同干預組細胞凋亡率不同(見圖3)，H2O2損傷組細胞凋亡率明顯高于對照組，分別為(51.22±1.78)%和(12.18±0.69)%，差異有統計學意義(P<0.001)，H2O2損傷組和17β-雌二醇保護組差異有統計學意義，分別為(51.22±1.78)%和(33.38±1.15)%，差異有統計學意義(P<0.001)，損傷加入保護劑后可以明顯減少細胞凋亡情況。加入PI3K/Akt抑制劑渥曼青霉素后凋亡率增加，為(41.22±1.32)%，與H2O2損傷組和17β-雌二醇保護組相比較，差異有統計學意義(P<0.001)。

注：A為空白對照組；B為H2O2損傷組；C為H2O2損傷+17β-雌二醇保護組；D為17β-雌二醇組;E為H2O2損傷+17β-雌二醇保護+渥曼青霉素組。右下和右上象限分別代表早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞，左下代表正常細胞。H2O2損傷組與對照組、17β-雌二醇保護組、17β-雌二醇保護+渥曼青霉素組比較，P<0.001。

圖3 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率

2.4 流式細胞術檢測HUVEC內ROS含量 定量檢測各組細胞內ROS含量不同(見圖4)，H2O2損傷組表達明顯高于其他組，與對照組和17β-雌二醇保護組相比較差異具有統計學意義(P<0.001)，Mean值分別為(53.72±1.25)、(16.07±0.61)、(26.38±0.78)，17β-雌二醇可下調H2O2引起的細胞內ROS含量，減少氧化應激損傷。

注：A為空白對照組；B為H2O2損傷組；C為H2O2損傷+17β-雌二醇保護組；D為17β-雌二醇組。H2O2損傷組與對照組、17β-雌二醇保護組、17β-雌二醇保護+渥曼青霉素組相比較，P<0.001。

圖4 流式細胞儀檢測DCFH-DA探針標記各組細胞內ROS含量

2.5 熒光顯微鏡觀察HUVEC內ROS活性檢測結果 H2O2損傷可使細胞內ROS生成增加，17β-雌二醇可減弱該作用，定性觀察可見各組ROS染色表達強度不同，17β-雌二醇可以減弱H2O2損傷導致的細胞內ROS產生。

3 討 論

冠心病和高血壓等心血管疾病在絕經前女性中的發病率明顯低于同齡男性[7]。同時發現，絕經后女性的心血管疾病發病率明顯高于絕經前女性，這提示可能與絕經期體內雌激素水平降低有關[8]。在動物實驗研究表明雌激素對心血管具有保護作用[9，10]，這一點在20世紀90年代關于絕經后女性是否使用雌激素具有保護心血管的作用的流行病學研究中得到支持[11-13]，甚至當時有觀察性研究提示，絕經后女性使用雌激素可以降低高達50%的心血管疾病危險性[1]，后來Stefanick等[14]關于使用雌激素和心血管疾病的Meta分析得出結論，絕經后使用雌激素可以減少30%的心血管疾病的發病率。但是在兩個薈萃分析研究中發現，既往存在心血管疾病的婦女，在絕經后使用雌激素治療并不能起到保護心血管的作用[15，16]。雌激素對早期的動脈粥樣硬化性心血管疾病具有一級保護作用，但是對高級別的心血管疾病沒有二級保護作用。

研究證明雌激素不僅限于對動脈粥樣硬化性心血管病有保護作用，而且對炎癥性刺激導致的增殖性血管疾病也有保護作用，如Kaposi肉瘤(KS)，一種罕見的血管增殖性疾病，來源于內皮細胞，HHV8在男女兩性的流行病學檢出率是一致的[17]，由此看來，雌激素對該種血管疾病的保護作用要超過對動脈粥樣硬化性心血管疾病的作用。

原則上來說，血管壁的所有組分都對雌激素有反應，包括各種血管內皮細胞，血管平滑肌細胞，心肌細胞和成纖維細胞。雌激素可以影響許多在炎癥性和增殖性血管性疾病中基因的表達，包括動脈粥樣硬化。直接影響的基因包括細胞活性分子，例如黏附分子、激素受體，還包括炎癥相關性，血管重建，血管再生和血管張力相關的特殊基因表達。

核因子相關因子(Nrf22)是一個重要的氧化和電應力傳感器，通過調節第二階段的防御和抗氧化基因的轉錄激活保證氧化還原平衡的維護[18]。心血管疾病患者細胞內ROS升高，這導致血管內皮功能受損和一氧化氮的生物利用度降低[19]。血紅素加氧酶-1(HO-1)是一種保護抗氧化酶，它在動脈粥樣硬化病變中經常為過度表達，并且可被Nrf2調節[20]。Nrf2經歷易位到細胞核，與抗氧化基因的抗氧化反應元件(ARE)相結合，促進轉錄。已經研究表明，大豆異黃酮的代謝物S-雌馬酚可以激活Nrf2/ARE信號通路，這是細胞抗氧化反應的主要組成部分，這個反應是通過PI3K/Akt和ER途徑介導的，表明這可能是大豆異黃酮保護血管內皮細胞免受氧化應激的具體機制[21]。最近的研究表明，Nrf2/ ARE信號通路可能是生物預防治療動脈粥樣硬化，糖尿病，高血壓和中風的一個目標通路。其中該信號通路的上游介導通路PI3K/Akt通路在很多細胞內過程中都有參與，包括細胞增殖和細胞死亡。上述研究還表明，加入PI3K/Akt的阻滯劑7，4′-二羥基異黃酮可以阻斷Nrf2的核遷移，這說明Nrf2發揮核內抗氧化作用主要是通過PI3K/Akt通路實現的[21]。本研究中重點檢測該通路重要蛋白PI3K和Akt的表達情況，發現17β-雌二醇可以明顯促進該通路核心蛋白的表達，作用同該通路的激活劑，從而使其介導下游通路發揮抗氧化作用，減輕血管內細胞損傷。

渥曼青霉素是一種真菌代謝產物，其通過與PI3K的催化亞單位p110結合，非競爭性和不可逆地抑制PI3K激酶活性，從而阻斷PI3K/Akt信號通路，是PI3K的特異性抑制劑[22]。

已有很多研究表明，17β-雌二醇可能在心血管疾病發病過程中發揮作用，例如通過增強VEGF-A下游的Norch通路刺激血管新生，通過結合雌激素受體激活MAPK信號通路的非基因效應而促進血管內皮增殖。本研究發現17β-雌二醇可以明顯提高H2O2損傷后血管內皮細胞的存活率，降低早期和晚期凋亡率，并且減少H2O2損傷后血管內皮細胞內的ROS含量，減少氧化應激導致的血管損傷，說明17β-雌二醇對于過氧化氫導致的血管內皮氧化應激損傷確實有保護作用。本研究發現17β-雌二醇可以明顯上調氧化應激損傷組內皮細胞中PI3K/Akt的表達，從而介導細胞抗氧化反應的主要通路Nrf2/ ARE信號通路而發揮抗氧化作用；另外PI3K/Akt信號通路還具有抗細胞凋亡作用，但在加入該通路的特異性抑制劑渥曼青霉素以后，17β-雌二醇抗氧化損傷的作用明顯減弱，說明PI3K/Akt信號通路可能都是17β-雌二醇抗氧化損傷的機制通路之一。

總之，雖雌激素可對女性心血管系統有多方面的作用，但對血管內皮細胞功能的調節在其心血管作用中占有重要地位，抗氧化損傷可能是雌激素產生心血管保護效應的重要途徑。

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(本文編輯 郭懷印)

山西醫科大學第一醫院(太原 030001)

呂吉元，E-mail:yaya20120710@163.com

R331.3 R256.2

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2015．14．011

1672-1349(2015)14-1616-04

2015-06-25)