走馬胎中化合物AG4對人鼻咽癌細胞裸鼠移植瘤的影響

陳 超，孫 艷，董憲喆，郭代紅，鄭小麗，穆麗華，劉 屏（解放軍總醫院臨床藥理研究室，北京 100853）

·實驗研究·

走馬胎中化合物AG4對人鼻咽癌細胞裸鼠移植瘤的影響

陳 超，孫 艷，董憲喆，郭代紅，鄭小麗，穆麗華，劉 屏（解放軍總醫院臨床藥理研究室，北京 100853）

目的：研究走馬胎中化合物AG4對人鼻咽癌細胞裸鼠移植瘤生長的影響。方法：建立人鼻咽癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型，以抑瘤率為指標研究化合物AG4的體內抑瘤作用及AG4干預對裸鼠的一般情況（體質量、活動、食欲等）的影響；同時采用實時熒光定量PCR法觀察AG4對腫瘤內凋亡相關基因表達的影響。結果：陽性藥順鉑組（2.00 mg·kg-1）對荷瘤裸鼠的抑瘤率為49.41%，3.02 mg·kg-1AG4組的抑瘤率為42.34%，AG4對裸鼠體質量及肝、脾、腎的臟器指數沒有明顯影響；AG4能明顯升高Bax和Bad基因的相對表達量，降低Bcl-2基因的相對表達量。結論：AG4在裸鼠體內對人鼻咽癌細胞有較強的抑制作用，對裸鼠沒有明顯的毒副作用，其作用機制可能與激活線粒體途徑誘導腫瘤細胞凋亡有關。

走馬胎；鼻咽癌；Bcl-2家族；裸鼠

人鼻咽癌是在鼻咽部形成的惡性腫瘤，其發生與EBV感染、遺傳缺陷和環境因素有關[1]，主要在東南亞、阿拉斯加、南非和中東等地發病率較高，尤其是在中國南部[2]。目前，放療和手術兩種方法主要應用于鼻咽癌早期和轉移，或者化療或放化療后的復發等癥狀。有報道[3]指出，成人和兒童鼻咽癌患者5年內的存活率大約都在60%。因此，發展新的治療方法和發現新的藥物用于鼻咽癌的治療很有必要。

化合物AG4[4]是從紫金牛科（Myrsinaceae）紫金牛屬植物走馬胎（Ardisia gigantifolia Stapf.，縮寫為AG）干燥的根莖中提取分離得到的一種三萜皂苷成分，其化學名為：3β-O-{α-L-吡喃鼠李糖基-(1→3)-[β-D-吡喃木糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖基}-西克拉敏A。本實驗室前期的研究結果表明[4-5]，AG4對人宮頸癌細胞（HeLa）、人膀胱癌細胞（EJ）、人胃癌細胞（BGC-823）及人肝癌細胞（HepG2）有明顯的增殖抑制作用。在此基礎上進一步研究發現，AG4在體外對人鼻咽癌細胞CNE的增殖有明顯的抑制作用。本文建立人鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤模型，考察不同劑量的AG4在裸鼠體內的抑瘤作用及可能的機制。

1 材料

1.1 細胞株

人鼻咽癌細胞CNE購于中國醫學科學院腫瘤醫院，由本實驗室復蘇、傳代、培養。

1.2 實驗動物

雄性BALB/C裸鼠50只，4 ～ 5周齡，體質量（18.96 ± 0.51） g，由解放軍軍事醫學科學院動物實驗中心提供，實驗動物質量合格證號：SCXX（京）2011-0004，飼養于無特定病原體（specific pathogen free，SPF）環境中。

1.3 實驗儀器

MyIQ熒光定量PCR儀（美國Bio-RAD公司）；恒溫金屬浴（北京金銀杏生物科技公司）；MCO-15AC二氧化碳培養箱（日本SANYO公司）；潔凈工作臺（北京亞泰科隆儀器技術有限公司）；TS100倒置生物顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.4 主要試劑

AG4（純度99%，中國人民解放軍總醫院藥理研究室提供）；順鉑（cisplatin，DDP，齊魯制藥有限公司）；0.9%氧化鈉注射液（青島華仁藥業股份有限公司）；RPMI 1640培養基（美國Gibco公司）；胎牛血清（FCS，美國HyClone公司）；胰蛋白酶干粉（美國Amresco公司）；Trizol（Invitrogen公司）；SybrGreen qPCR Mix和第一鏈反轉錄試劑盒（TOYOBO公司）。

1.5 試藥配制

AG4溶液的配制：精確稱取6.34 mg的AG4凍干粉，溶解于21 mL的0.9%氯化鈉注射液中，混勻，無菌過濾。工作液稀釋至相應濃度，分裝后于– 20 ℃儲存。DDP溶液的配制：精確稱取2.40 mg的DDP凍干粉，溶解于12 mL的0.9%氯化鈉注射液中，混勻，無菌過濾，分裝后于– 20 ℃儲存。

2 方法

2.1 細胞培養

細胞置于含體積分數為10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，在37 ℃，5% CO2，飽和濕度的條件下培養，2 d換液一次，細胞生長至70% ～ 80%融合時傳代。

2.2 人鼻咽癌細胞CNE裸鼠皮下移植瘤模型的建立

將處于對數生長期的CNE細胞胰酶消化，離心，用不含血清的RPMI 1640培養基重懸，制備成細胞密度為7.50×l09·L-1的單細胞懸液，按每只0.2 mL（約1.50×l06個細胞）接種于裸鼠右前肢皮下。接種CNE細胞后，每日觀察一次，以瘤塊長徑大于5 mm且觸之質硬視為造模成功的標準。

2.3 分組及給藥

待瘤體長到200 mm3時，將所有裸鼠隨機分成5組，陰性對照組（等體積NS）、DDP陽性藥組（2.00 mg·kg-1）及AG4低、中、高3個劑量組（0.76、1.51、 3.02 mg·kg-1），每組10只，按照各組相應的給藥劑量，每2天腹腔注射給藥一次，每只每次0.2 mL，給藥6次，陰性對照組給予等體積的0.9%氯化鈉注射液。

2.4 AG4對人鼻咽癌裸鼠體內移植瘤生長情況的影響

每2天稱量裸鼠體質量和測量移植瘤體積1次，每次用電子數顯卡尺測量移植瘤的長徑（a）及與之垂直的短徑（b），計算腫瘤體積（tumor volume，TV），TV=a×b2/2，并繪制各組移植瘤的生長曲線。末次給藥后第3日，稱重，觀察給藥前后裸鼠體重的變化；頸椎脫臼裸鼠，剖取腋下瘤組織，按公式[6]計算腫瘤生長抑制率（inhibition rate，IR） = [（陰性對照組平均瘤重–干預組平均瘤重）/陰性對照組平均瘤重]×100%；取出肝、脾、腎，分別稱重，并計算臟器指數。陰性對照組腫瘤平均瘤重小于1 g，或20%腫瘤重量小于400 mg，表示腫瘤生長不良，實驗作廢。參考文獻的評價標準[7]：腫瘤生長抑制率＜ 30%為無效；腫瘤生長抑制率≥30%，并經統計學處理，P ＜ 0.05為有效。

2.5 Real time PCR

取約100 mg裸鼠原位移植瘤采用Trizol一步法抽取瘤組織總RNA，定量后取2 μg總RNA逆轉錄成cDNA；以管家基因β-actin為內參照，上下游引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司設計合成。B c l-2上游引物：5'-TCTGTGGATGACTGAGTACCTGAAC-3'，下游引物：5'-AGAGACAGCCAGGAGAAATCAAAC-3'；Bax上游引物：5'-CAGCAAACTGGTGCTCAAGG-3'，下游引物：5'-GCCACAAAGATGGTCACGGT-3'；Bad上游引物：5'-CGGAGGATGAGTGACGAGTTT-3'，下游引物：5'-GGGTGGAGTTTCGGGATGTG-3'；β-actin上游引物：5'-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3'，下游引物：5'-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'。采用MyIQ熒光定量PCR儀，反應條件為95 ℃預變性2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環，并用自帶分析軟件分析每個樣本目的基因的ΔCt值，以2-ΔΔCt方法比較用藥組目的基因相對于對照組的表達。

2.6 數據處理

采用SPSS 19.0軟件對數據作統計分析，數據用（x± s ）表示，n = 10。組內數據進行正態分布檢驗，組間數據進行方差齊性檢驗和單因素方差分析（oneway，ANOVA），并采用SNK和LSD法進行兩兩比較，P ＜ 0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 AG4對荷瘤裸鼠移植瘤生長的影響

裸鼠右前肢皮下接種CNE細胞，第5天接種部位即可見觸之質硬的組織并達到造模標準，造模成功率100%。接種第13天，移植瘤體積長到200 mm3左右時，將裸鼠隨機分組后，開始腹腔給藥。以給藥時間為橫坐標，移植瘤體積為縱坐標，作移植瘤生長曲線。如圖1所示，各干預組移植瘤生長均較陰性對照組慢。其中DDP組最慢，并且AG4高劑量組與之相當，AG4中劑量組次之，AG4低劑量組與陰性對照組移植瘤體積大小接近。AG4對瘤重的影響如表1所示，0.76、1.51和3.02 mg·kg-1劑量的AG4的抑瘤率分別為7.31%（P ＞ 0.05）、24.60%（P ＜ 0.01）和42.34%（P ＜0.01），且呈現良好的劑量-效應關系；DDP對照組的抑瘤率為49.41%。

圖1 AG4對人鼻咽癌細胞CNE裸鼠移植瘤生長的影響Fig 1 Effect of AG4 on human nasopharyngeal carcinoma CNE xenograft tumor growth in nude mice

表1 AG4對人鼻咽癌細胞CNE裸鼠體內移植瘤生長的抑制作用Tab 1 Inhibition effect of AG4 on xenograft tumor growth in human nasopharyngeal carcinoma CNE nude mice

3.2 AG4對荷瘤裸鼠體質量及免疫器官臟器系數的影響

AG4化療后對裸鼠毒副作用的觀察實驗期間，50只裸鼠無1例死亡，但是隨著移植瘤的長大，裸鼠精神狀態不佳，活動減少，食欲減退，但是藥物干預組在給藥后的第3天能恢復正常。如表2所示，各組裸鼠在給藥前后體質量均有下降趨勢，并且DDP組裸鼠平均體質量下降最明顯，但是各給藥組與陰性對照組比較差異均沒有統計學意義（P ＞ 0.05）。末次給藥后第3天，取裸鼠重要免疫器官稱重，發現各干預組鼻咽癌裸鼠的肝、腎重量與NS組接近，如 圖2所示；DDP組和AG4高劑量組的脾指數雖有所增加，但與NS組相比，差異均沒有統計學意義（P ＞ 0.05）。

表2 AG4對人鼻咽癌細胞CNE裸鼠體質量的影響Tab 2 Effect of AG4 on the body weight of human nasopharyngeal carcinoma CNE nude mice

圖2 AG4對荷瘤裸鼠臟器系數的影響Ⅰ– AG4對鼻咽癌細胞CNE裸鼠肝、腎的影響，Ⅱ– AG4對鼻咽癌細胞CNE裸鼠脾指數的影響；A – NS組，B – DDP組，C – AG4（0.76 mg·kg-1）組，D – AG4（1.51 mg·kg-1）組，E – AG4（3.02 mg·kg-1）組Fig 2 Effects of AG4 on organ index of human nasopharyngeal carcinoma CNE nude miceⅠ – effect of AG4 on liver and kidney index of human nasopharyngeal carcinoma CNE nude mice, Ⅱ – effect of AG4 on spleen index of human nasopharyngeal carcinoma CNE nude mice; A – NS group, B –DDP group, C – AG4 (0.76 mg·kg-1) group, D – AG4 (1.51 mg·kg-1) group, E – AG4 (3.02 mg·kg-1) group

3.3 AG4對荷瘤裸鼠腫瘤相關基因表達的影響

采用RT-PCR法檢測線粒體通路上凋亡相關基因的表達情況。由圖3可見，AG4（1.51 mg·kg-1）、AG4（3.02 mg·kg-1）組Bax和Bad基因的相對表達量均明顯高于正常對照組（P ＜ 0.01）；給予AG4治療后抗凋亡基因Bcl-2的表達量降低。

4 討論

圖3 AG4對荷瘤裸鼠腫瘤凋亡相關基因表達的影響A – NS組，B – AG4（0.76 mg·kg-1）組，C – AG4（1.51 mg·kg-1）組，D – AG4（3.02 mg·kg-1）組；與A組比較，**P ＜ 0.01Fig 3 Effects of AG4 on Bcl-2, Bax, Bad mRNA expression of human nasopharyngeal carcinoma CNE nude miceA – NS group, B – AG4 (0.76 mg·kg-1) group, C – AG4 (1.51 mg·kg-1) group, D – AG4 (3.02 mg·kg-1) group; compared with group A,**P ＜ 0.01

裸鼠目前已成為醫學生物學研究領域中不可缺少的實驗動物模型。特別是在腫瘤學、免疫學、毒理學及有效藥品的篩選等實驗方面，它有著特殊的價值。多年來，研究者建立了多種鼻咽癌動物模型，包括誘發性鼻咽癌動物模型、移植性鼻咽癌動物模型、轉基因和基因敲除鼻咽癌動物模型、鼻咽癌轉移動物模型等[8]。其中建立移植性鼻咽癌動物模型的成功率較高，其方式主要有腫瘤組織塊接種、組織塊懸液注射、腫瘤細胞懸液注射等。已有不少學者采用移植法成功的將人鼻咽癌細胞移植到裸鼠皮下，并證實此法長出的瘤組織能保持原發癌的形態結構、生物學特性和遺傳學特征[9-10]。腫瘤細胞懸液注射法建模，即將目的瘤細胞接種在裸鼠背部或腋下部的皮下，此法操作簡單，建模周期短，腫瘤位置表淺便于觀察和測量瘤體的大小。

故本文采用CNE細胞懸液直接接種于裸鼠腋下部的皮下，成功建立了鼻咽癌裸鼠皮下移植瘤模型，待移植瘤長到200 mm3左右后開始腹腔給藥。由各組鼻咽癌移植瘤的生長曲線可知，AG4腹腔注射給藥組移植瘤組織生長均較NS組慢，其中3.02 mg·kg-1AG4組與陽性藥DDP組生長速度接近，而0.76 mg·kg-1AG4組與NS組無明顯差異。連續給藥6次后，發現3.02 mg·kg-1AG4組與DDP組的平均抑瘤率分別為42.34%和49.41%，均大于30%，根據評價標準，說明3.02 mg·kg-1的AG4能有效的抑制人鼻咽癌細胞CNE裸鼠移植瘤的生長。為更深入的研究各條通路上的凋亡相關基因的表達情況，采用RT-PCR法對AG4抗腫瘤的機制進行了分子水平上的進一步探討，檢測了線粒體通路上的促凋亡基因Bax、Bad和抗凋亡基因Bcl-2。實驗結果顯示，AG4能明顯升高Bad、Bax基因的表達量，下調Bcl-2基因的表達。可見，Bcl-2家族的成員在AG4抗腫瘤作用中起著關鍵的作用。

目前治療腫瘤的方法包括手術、放療、化療或者多種方法配合，但是大多數方法都會給患者帶來不同程度的副反應，常見的有嘔吐、脫發、體質量下降等，甚至有的抗腫瘤藥物在殺傷腫瘤細胞的同時，對機體免疫功能也有很大的影響，常引起胸腺指數、脾指數等免疫指標的異常[11]。給藥期間發現，裸鼠在腹腔注射AG4溶液后當天活動減少，食欲減弱，但是在第3天恢復正常，不影響下一次給藥。末次給藥后稱裸鼠體質量，比較給藥前后各組裸鼠的平均體質量變化。結果顯示，各組裸鼠平均體質量均較給藥前有所降低，其中DDP組和高劑量AG4組最為明顯，中劑量AG4組次之，低劑量AG4組平均體質量降低的幅度小于NS組，雖然體質量都有所下降，但是與NS組比較，沒有顯著性差異（P ＞ 0.05）。末次給藥結束后，取裸鼠相應組織稱重，發現各給藥組肝和腎的重量與NS組比較，沒有明顯差異，說明AG4在短時間內對裸鼠肝和腎沒有明顯的毒副作用。同時發現，陽性藥順鉑組和高劑量AG4組的脾指數與對照組相比略有升高。推斷，AG4不僅不影響裸鼠的免疫系統，有可能還會改善其免疫功能，具體機制還需深入研究。

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Inhibition of compound AG4 from Ardisia gigantifolia Stapf. on xenograft tumor growth of human nasopharyngeal carcinoma in nude mice

CHEN Chao, SUN Yan, DONG Xian-zhe, GUO Dai-hong, ZHENG Xiao-li, MU Li-hua, LIU Ping(Department of Clinical Pharmacology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

Objective:To investigate the infl uence of compound AG4 derived from Ardisia gigantifolia Stapf. on xenograft tumor of human nasopharyngeal carcinoma (NPC) in nude mice.Methods:Human NPC nude mice model were established, and the inhibition rate (IR) was the index to evaluate the tumor growth suppression of AG4 in vivo. Simultaneously, general conditions (weight, action, appetite) of nude mice and the expression of Bcl-2, Bad and Bax mRNA by real time PCR method were observed during AG4 interference.Results:The IR of positive control group (cisplatin 2.00 mg·kg-1) and AG4 group (3.02 mg·kg-1) was 49.41% and 42.34% respectively. The effect of AG4 on the weight lose of nude mice was not signifi cant comparing with negative control group, and the toxicity of AG4 to the vital organs (liver, spleen and kidney) and immunity index (spleen index) was not obvious in short period. AG4 could increase the Bax and Bad mRNA expression, and decrease the Bcl-2 mRNA expression.Conclusion:AG4 had obvious inhibition effects on xenograft tumor in human NPC nude mice, and with no outstanding adverse effects, the mechanisms may relate to the induction of tumor apoptosis due to the activation of mitochondria signal pathway.

Ardisia gigantifolia Stapf.; Nasopharyngeal carcinoma; Bcl-2 family; Nude mice

R96

A

1672 – 8157(2015)01 – 0012 – 04

2014-10-14

2014-12-26）

國家自然科學基金資助項目（31370006）

劉屏，女，研究員，主要從事中藥藥理和中藥化學方向的研究。E-mail：liuping301@126.com

陳超，女，副主任藥師，主要從事腫瘤藥理學的研究。E-mail：cherie_301@126.com