HPLC-MS/MS方法同時檢測人血漿中異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和左氧氟沙星的濃度

趙冠人，彭明麗，申 健，欒瀟瀟，西 娜（解放軍309醫院藥劑科，北京 100091）

HPLC-MS/MS方法同時檢測人血漿中異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和左氧氟沙星的濃度

趙冠人，彭明麗，申 健，欒瀟瀟，西 娜（解放軍309醫院藥劑科，北京 100091）

目的：建立同時測定人血漿中5種抗結核藥物異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和左氧氟沙星濃度的HPLC-MS/MS方法，以便用于肺結核患者該5種藥物的血藥濃度監測。方法：以對乙酰氨基酚為內標，血漿樣品經甲醇沉淀蛋白處理后檢測。采用Agilent Poroshell 120SB C18色譜柱（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）為分析柱，ZORBAX SB C18柱（2.1 mm×12.5 mm，5 μm）為保護柱，以0.2%甲醇-0.2%醋酸溶液為流動相，梯度洗脫，使用離子噴霧離子化源（ESI），以正離子多反應監測（MRM）方式進行檢測，異煙肼m/z 138.0→121.0，利福平m/z 823.2→791.2，乙胺丁醇m/z 205.2→116.1，吡嗪酰胺m/z 124.1→79.0，左氧氟沙星m/z 362.2→261.1，對乙酰氨基酚m/z 152.0→110.0。分析時間為12 min。結果：血漿中內源性物質對測定無干擾，異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、左氧氟沙星的線性范圍分別為0.20 ～ 9.81 μg·mL-1、0.60 ～ 30.12 μg·mL-1、0.10 ～4.89 μg·mL-1、1.01 ～ 50.60 μg·mL-1、0.10 ～ 5.00 μg·mL-1。批內、批間精密度（RSD）均小于10%，準確度（RE）均小于10%。結論：本方法特異性強，靈敏度高，測定結果可靠，適用于臨床血漿樣品的高通量分析。

異煙肼；利福平；乙胺丁醇；吡嗪酰胺；左氧氟沙星；高效液相色譜-串聯質譜；血藥濃度；監測

結核病是由結核分枝桿菌引起的慢性呼吸道傳染病，20世紀90年代以來該病在全球范圍內呈現死灰復燃態勢，已成為威脅人類健康的重大公共衛生問題。據統計[1]，我國患有結核病的人數位居世界第2位，僅次于印度，約5.5億人受到過結核菌感染，每年新增結核病患者150萬，死亡人數每年高達13萬人，總體控制形勢不容樂觀。結核病的預防和治療主要依賴于針對結核分枝桿菌的長期聯合化療，化療藥血藥濃度過低達不到最低抑菌濃度，反而導致耐藥，血藥濃度過高又會引起不良反應的增加。因此，在臨床實踐中監測抗結核藥的血藥濃度對于結核病的治療意義重大。

近幾十年來在新型抗結核藥開發上沒有明顯進展，一線抗結核藥如異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺等在結核病的治療中仍占主導地位。另外氟喹諾酮類抗生素的抗結核菌活性也日益受到重視，其代表藥物左氧氟沙星在結核病的治療實踐中收到了良好的效果[2]。由于結核病的治療方案是多種藥物長期聯合應用，開發一種可以同時檢測幾種主要抗結核藥物血藥濃度的方法，對于提高檢測效率，實現患者血樣的高通量檢測具有重要意義。

文獻[3]報道多用HPLC-UV法測定主要抗結核藥物的血藥濃度，然而鹽酸乙胺丁醇因無紫外吸收，不能用紫外檢測器進行分析，一般采用蒸發光散射檢測器或衍生化后再進行紫外檢測等方法[4-5]。也有采用HPLC-MS/MS法[6-7]進行測定的報道，還有文獻[8]報道采用反相高效液相色譜法測定左氧氟沙星濃度，但研究范圍不夠全面。本文利用HPLC-MS/MS方法建立了一種可同時檢測一線抗結核藥物異煙肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺與左氧氟沙星的高效快速檢測法并用于臨床血藥濃度監測。

1 儀器與試藥

API 3200型三重四級桿串聯質譜儀，配有離子噴霧離子化源（ESI）以及Analyst 1.4.1數據處理軟件（美國Applied Biosystem公司）；Prominence LC-20A超快速高效液相色譜系統，包括CBM-20A系統控制器，LC-20AD二元輸液泵，DGU-20A3脫氣裝置，SIL-20AHT自動進樣器（日本Shimadzu公司）；VDRTEX-5型旋渦混合器（其林貝爾儀器制造有限公司）；5420型臺式高速離心機（德國Eppendorf公司）；MG-2200型氮氣吹干儀（東京理化器械株式會社）。

異煙肼（INH，中國藥品生物制品檢定所，批號100578-200401）；利福平（REP，中國藥品生物制品檢定所，批號130496-200702）；鹽酸乙胺丁醇（EMB，中國藥品生物制品檢定所，批號100165-201104）；吡嗪酰胺（PZA，中國藥品生物制品檢定所，批號100178-200403）；左氧氟沙星（LVX，中國藥品生物制品檢定所，批號130455-201005）；對乙酰氨基酚（IS，中國藥品生物制品檢定所，批號100018-200408）；甲醇、醋酸均為色譜純，水為Milli-Q制備超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm（25 ℃）。患者血漿樣品由解放軍309醫院結核病研究所提供，空白血漿由志愿者提供。

2 方法與結果

2.1 HPLC-MS/MS分析條件

2.1.1質譜條件 離子源：離子噴霧離子化源（ion spray）；離子噴射電壓（IS）：5000 V；離子源溫度（TEM）：350 ℃；源內氣體1（GS1，N2）：25 psi；源內氣體2（GS2，N2）：45 psi；氣簾氣體壓力（Cur Gas）：30 psi。正離子方式檢測；掃描方式為多重反應監測（MRM）；其他質譜參數見表1。

表1 5種抗結核藥物及內標的保留時間、母離子、子離子及部分質譜參數Tab 1 Retention time, parention, daughter ion and some mass spectra parameters of 5 antituberculosis drugs

2.1.2色譜條件 色譜柱：Agilent Poroshell 120SB C18柱（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）；柱溫35 ℃；流動相：0.2%甲醇-0.2%醋酸溶液。采用梯度洗脫，甲醇濃度按以下時間點設置（0.01 min，5%；2.50 min，17%；5.00 min，35%；6.00 min，70%；6.01 min， 80%；9.00 min，90%；9.01 min，5%；12.00 min， 5%）；流速：0.5 mL·min-1。進樣量：5 μL。

2.2 溶液的配制

精密稱取各個對照品適量，加50%甲醇溶解，定量配制成濃度分別為INH 9.81 μg·mL-1、REP 30.12 μg·mL-1、EMB 4.89 μg·mL-1、PZA 50.60 μg·mL-1、LVX 5.00 μg·mL-1的標準貯備液。精密稱取內標IS適量，加甲醇溶解，定量配制成濃度為16.16 μg·mL-1的內標貯備液，REP與內標貯備液置于– 20 ℃冰箱保存，其他貯備液置于6 ℃冰箱保存，臨用時用50%甲醇稀釋至所需濃度。

2.3 全血樣品的處理

取血漿樣品100 μL于1.5 mL離心管中，加入內標溶液10 μL，加入甲醇300 μL，渦旋混合1 min，離心12 min（13 200 r·min-1，4 ℃），取上清液200 μL，加入去離子純化水400 μL，渦旋混合1 min，取上清液5 μL進樣分析。

2.4 質譜分析

采取正離子方式檢測，將各個對照品溶于流動相中，按“2.3”項下條件操作，于二級全掃描質譜圖中獲得各對照品準分子離子峰，選擇準分子離子峰進行碰撞誘導電離，生成主要的碎片離子峰用于定量，相應質譜參數見表1。

2.5 專屬性考察

分別取人空白血漿、加入對照品溶液和內標溶液的血漿樣品、服用相應抗結核藥物患者的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理，另取對照品溶液和內標溶液適量，依“2.1”法進樣分析，得到色譜圖，見圖1，各樣品保留時間見表1。由圖1可知，各樣品分離度良好，內源性物質對測定無干擾。

圖1 典型色譜圖A – 空白血漿，B – 加入對照品溶液和內標溶液的血漿樣品，C – 患者的血漿樣品；1 – 乙胺丁醇，2 – 異煙肼，3 – 吡嗪酰胺，4 – 內標（對乙酰氨基酚），5 –左氧氟沙星，6 – 利福平Fig 1 Typical chromatogramsA – blank plasma, B – blank plasma spiked with control sample and internal standard solution, C – plasma of patient; 1 – ethambutol, 2 –isoniazid, 3 – pyrazinamide, 4 – internal standard (acetaminophen), 5 –levofl oxacin, 6 – rifampicin

2.6 線性關系考察

平行量取6份空白血漿90 μL，分別加入對照品系列溶液10 μL，使EMB濃度依次為0.10、0.24、0.49、0.98、2.44、3.91、4.89 μg·mL-1，INH濃度依次為0.20、 0.49、0.98、1.96、4.90、7.85、9.81 μg·mL-1，PZA濃度依次為1.01、2.53、5.06、10.12、25.30、40.48、50.60 μg·mL-1，LVX濃度依次為0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、4.00、5.00 μg·mL-1，REP濃度依次為0.60、1.51、3.01、6.02、15.06、24.10、30.12 μg·mL-1，按“2.3”項下方法處理后，依照“2.1”下條件進樣測定，以樣品與內標峰面積比值（Y）對濃度（C）繪制回歸曲線，得到回歸方程分別為：YEMB= 0.122 C + 9.14×10-3，r = 0.999 3，線性范圍0.10 ～ 4.89 μg·mL-1；YINH= 0.015 C + 6.58×10-3，r = 0.999 6，線性范圍0.20 ～ 9.81 μg·mL-1；YPZA= 0.036 4 C + 1.11×10-2，r = 0.999 4，線性范圍1.01 ～ 50.60 μg·mL-1；YLVX= 0.090 6 C + 2.42×10-3，r = 0.999 5，線性范圍0.10 ～ 5.00 μg·mL-1；YREP= 0.058 6 C – 3.64×10-2，r = 0.999 1，線性范圍0.60 ～ 30.12 μg·mL-1。

2.7 基質效應

量取空白血漿90 μL于1.5 mL離心管，不加內標，按“2.3”項下操作，向獲得的上清液中分別精密加入各標準溶液和內標溶液，配制低、中、高三個濃度水平的樣品，取5 μL進樣分析，測定各色譜峰面積，求出與對應濃度對照品溶液測得峰面積的比值為基質效應，結果表明，EMB、INH、PZA、LVX及REP在人血漿中的基質效應分別為（92.25±3.56）%、（91.97±2.67）%、（90.55±1.53）%、（91.53±3.70）%、（91.58±4.42）%，定量過程不受基質效應影響。

2.8 準確度與精密度

分別于90 μL的空白血漿中加入低、中、高3種濃度的各個抗結核藥物對照品溶液10 μL，混勻，得低、中、高3種不同濃度EMB（0.24、0.98、3.91 μg·mL-1），INH（0.49、1.96、7.85 μg·mL-1），PZA（2.53、10.12、40.48 μg·mL-1），LVX（0.25、1.00、4.00 μg·mL-1）及REP（1.51、6.02、24.10 μg·mL-1）的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理，依法測定批內與批間的準確度與精密度（3 d），結果見表2。

2.9 提取回收率

配制5種抗結核藥物低、中、高濃度的血漿樣品各3份，按“2.3”項下操作后依法進樣，記錄峰面積。另取經過預處理的血漿空白基質中加入3個相應濃度的對照品溶液進行分析。以每一濃度兩種處理方法得到的峰面積比值計算提取回收率。結果表明，EMB、INH、PZA、LVX及REP在人血漿中的提取回收率分別為（89.70±5.82）%、（89.78±2.14）%、（87.96±2.24）%、（86.22±1.50）%、（92.21±4.26）%，定量過程不受基質效應影響。

表2 5種抗結核藥物的準確度與精密度.n= 6Tab 2 Accuracy and precision of 5 antituberculosis drugs.n= 6

2.10 穩定性考察

配制低、中、高3種不同濃度EMB（0.24、0.98、3.91 μg·mL-1）、INH（0.49、1.96、7.85 μg·mL-1）、PZA（2.53、10.12、40.48 μg·mL-1）、LVX（0.25、1.00、4.00 μg·mL-1）及REP（1.51、6.02、24.10 μg·mL-1）的血漿樣品各3份，分別考察室溫放置24 h、經過3次凍融后各藥品的穩定性，按“2.3”項下對樣品進行處理，測定5種藥物濃度。結果各濃度與0時刻比較，變化率均小于15%，表明在上述貯存條件下樣品較為穩定，不影響本方法對樣本的準確測定。

2.11 患者血藥濃度測定

選取10例我院收治的同時服用5種抗結核藥的肺結核患者，于連續服藥7 ～ 14 d后的第2天清晨服藥后2 h，取靜脈血2 ～ 3 mL，依法處理并進樣測定，測得INH濃度0.60 ～ 4.10 μg·mL-1，EMB濃度0.50 ～3.00 μg·mL-1，PZA濃度8.30 ～ 42.30 μg·mL-1，REP濃度0.30 ～ 27.70 μg·mL-1，LVX濃度0.30 ～ 3.90 μg·mL-1，均在標準曲線范圍內。

3 討論

3.1 色譜柱和流動相的選擇

由于幾種抗結核藥物的極性差異比較大，為了獲得良好的峰形及分離度，實驗嘗試了多種色譜柱，ZORBAX SB C18，ZORBAX Eclipse Plus C18，Poroshell 120SB C18柱等，最終采用Agilent Poroshell 120SB C18色譜柱（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）為分析柱，ZORBAX SB C18柱（2.1 mm×12.5 mm，5 μm）為保護柱。流動相方面對醋酸溶液、甲醇-磷酸溶液等流動相系統，以及流動相間不同配比條件進行了考察，最終確定0.2%甲醇-0.2%醋酸溶液為流動相，梯度洗脫，結果表明，該方法分離效果好，分析時間短。

3.2 血漿樣本處理方面的優化

本文預實驗對比了液-液萃取法與甲醇直接沉淀蛋白法的效果，結果發現液-液萃取法操作較為復雜且回收率較低，而甲醇直接沉淀蛋白后，在上清液中加入2倍體積去離子水，可以起到改善峰形的效果，鑒于此法操作簡便，回收率高，且靈敏度完全能滿足要求，故本文采取甲醇直接沉淀蛋白法處理血漿樣品。

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Simultaneous determination of isoniazid, rifampicin, ethambutol, pyrazinamide and levofloxacin in human plasma by HPLC-MS/MS

ZHAO Guan-ren, PENG Ming-li, SHEN Jian, LUAN Xiao-xiao, XI Na(Department of Pharmacy, the 309th Hospital of PLA, Beijing 100091, China)

Objective：To establish a method for the simultaneous determination of isoniazid, rifampicin, ethambutol, pyrazinamide and levofl oxacin in human plasma by HPLC-MS/MS, and provide the convenience about blood drug monitoring of pulmonary tuberculosis patients.Methods:Acetaminophen was used as internal standard. The proteins of plasma samples were precipitated with methanol. The supernatant fl uid was separated on the Agilent Poroshell 120SB C18column (4.6 mm × 50 mm, 2.7 μm) and guarded by the ZORBAX SB C18column (2.1 mm × 12.5 mm, 5 μm). The mobile phase consisted of 0.2% of methanol and 0.2% of acetic acid in gradient elution. Electrospray ionization (ESI) source was applied and operated in the positive multiple reaction monitoring (MRM) mode. The transition of m/z was 138.0→121.0 for isoniazid, 823.2→791.2 for rifampicin, 205.2→116.1 for ethambutol, 124.1→79.0 for pyrazinamide, 362.2→261.1 for levofl oxacin and 152.0→110.0 for acetaminophen. Each analysis was completed within 12 minutes.Results:Chromatograms showed no endogenous interfering peaks with blank samples. The linear ranges were 0.20 – 9.81 μg·mL-1for isoniazid, 0.60 – 30.12 μg·mL-1for rifampicin, 0.10 – 4.89 μg·mL-1for ethambutol, 1.01 – 50.60 μg·mL-1for pyrazinamide, 0.10 – 5.00 μg·mL-1for levofl oxacin respectively. The intra-day and inter-day precision (RSDs) were less than 10%. The accuracy (RE) was less than 10%.Conclusion:The method is specifi c, sensitive and accurate, and proved to be suitable for the simultaneous determination of isoniazid, rifampicin, ethambutol, pyrazinamide and levofl oxacin in human plasma from clinical plasma samples.

Isoniazid; Rifampicin; Ethambutol; Pyrazinamide; Levofl oxacin; HPLC-MS/MS; Blood drug concentration; Monitoring

R917

A

1672 – 8157(2015)01 – 0016 – 04

2014-03-12

2014-07-29）

首都臨床特色應用研究專項資助項目（Z141107002514023）

趙冠人，男，副主任藥師，主要從事臨床藥理學工作。E-mail：yanliqun@sohu.com