漢防己甲素對小鼠腦缺血再灌注損傷的影響

阮 林 金文香 許陽英 連肖強 李 莉 黃煥森

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510260

漢防己甲素對小鼠腦缺血再灌注損傷的影響

阮 林 金文香 許陽英 連肖強 李 莉 黃煥森

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510260

目的觀察漢防己甲素(Tetrandrine，TET)對小鼠腦缺血再灌注損傷的影響，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)角度探討其分子機制。方法隨機將雄性Balb/c小鼠90只分為假手術(shù)組(S組，n=30)、缺血再灌注組(I/R組，n=30)與TET處理組(n=30)，HE染色觀察病理結(jié)果，神經(jīng)功能缺陷評分評價腦損傷情況，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法檢測腦梗死體積，干濕重法計算腦含水量，western blot法檢測缺血側(cè)大腦皮層ERS和凋亡蛋白表達。結(jié)果與S組比較，I/R和TET組神經(jīng)功能學(xué)評分(NDS)評分和腦含水量升高(P＜0.05)，腦梗死體積增大(P＜0.05)，GRP78、CHOP和caspase-12表達上調(diào)(P＜0.01);與I/R組比較，TET組NDS評分和腦含水量降低(P＜0.05)，腦梗死體積減小(P＜0.05)，GRP78、CHOP和caspase-12表達下調(diào)(P＜0.05)。結(jié)論TET顯著減輕小鼠腦組織I/R損傷，與降低I/R誘導(dǎo)的ERS和ERS介導(dǎo)的細胞凋亡有關(guān)。

漢防己甲素;缺血再灌注;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;損傷

缺氧缺血、自由基產(chǎn)生及Ca2+穩(wěn)態(tài)破壞等引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，表現(xiàn)為ERS標(biāo)志分子物葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein78，GRP78)表達和相關(guān)細胞凋亡途徑，如C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)和半胱天冬酶-12(caspase-12)的激活，加重缺血損傷［1-4］。缺血再灌注是急性腦梗死再通后、心跳驟停、休克常見的病理生理過程。漢防己甲素(Tetrandrine，TET)是防己科粉防己的主要活性成分，為雙芐基異喹啉類化合物，具有鎮(zhèn)痛、抗感染、改善微循環(huán)的作用［5-6］。本研究觀察TET是否抑制過度ERS反應(yīng)而減輕腦缺血再灌注損傷，以闡明減輕缺血再灌注損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組

雄性Balb/c小鼠90只，8周齡，廣東省實驗動物中心提供，用隨機數(shù)字表法將其分為三組(n=30):假手術(shù)組、缺血再灌注組和TET處理組。假手術(shù)組只分離頸總動脈，缺血再灌注組和TET處理組制備模型。后TET處理組于再灌注開始腹腔注射TET 30 mg/kg(上海阿拉丁試劑，純度＞98%)，假手術(shù)組及缺血灌注組給予等體積生理鹽水。

1.2 模型建立

線栓法制備小鼠右大腦中動脈缺血再灌注模型。2%異氟醚誘導(dǎo)下，分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈，夾閉頸內(nèi)動脈遠心端，頸總動脈分叉下方剪切口，將5-0的尼龍線插入頸內(nèi)動脈1 cm。缺血2 h，拔掉線栓記為再灌注開始時間。

1.3 神經(jīng)功能學(xué)(NDS)評分

每組取10只小鼠再灌注2 h和24 h行NDS評分。0分:無異常行為學(xué);l分:提尾時左側(cè)前肢不能伸直;2分:行走時向左側(cè)旋轉(zhuǎn);3分:行走時向左側(cè)傾倒; 4分:無自發(fā)活動，神志喪失。神經(jīng)缺陷評分后進行后續(xù)HE染色和腦含水量測定。

1.4 HE染色

每組取5只小鼠于再灌注后24 h時，深麻醉下斷頭取腦組織，脫水后冰凍切片，HE染色，光鏡觀察病理結(jié)果。

1.5 腦含水量測定

每組分別各取5只小鼠深麻醉下斷頭取腦組織，缺血再灌注24 h后取缺血側(cè)大腦組織，用電子天平稱量其濕重。以120℃烘干。腦含水量=(濕重-干重)÷濕重×100%。

1.6 腦梗死體積測定

每組分別各取5只小鼠深麻醉下斷頭取腦組織，缺血再灌注24 h后去除嗅球、小腦及低位腦干，-20℃中冷凍20 min，行連續(xù)冠狀切片，厚約2 mm，置于2% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)中，37℃下恒溫避光孵育20 min，正常腦組織染成紅色，梗死灶呈白色。4%多聚甲醛中固定20 min，Image Pro Plus 6.0軟件分析腦梗死體積百分比。

1.7 western blot測定

每組分別各取15只小鼠，每個蛋白取5只小鼠進行western blot實驗，深麻醉下斷頭取腦組織，缺血再灌注24 h后取缺血側(cè)大腦皮質(zhì)，裂解后上清BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE變性凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，GRP78、CHOP和caspase-12抗體(1∶1000，Santa cruz)4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL顯色。Quantity One軟件分析結(jié)果，β-actin為內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多組間均數(shù)兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡HE染色結(jié)果

光鏡下假手術(shù)組小鼠大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細胞體積未見異常，排列緊密，核仁清晰;缺血再灌注組小鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細胞排列紊亂，出現(xiàn)大量紅色神經(jīng)細胞，出現(xiàn)胞核固縮，胞體縮小變形，尼氏體消失，胞質(zhì)嗜酸性明顯增強;TET處理組小鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細胞體積增大，失去極性細胞，紅色神經(jīng)細胞較缺血再灌注組減少，神經(jīng)細胞損傷更輕。

2.2 NDS評分結(jié)果

與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和TET處理組的NDS評分升高(均P＜0.05)。與缺血再灌注組比較，漢防己甲素處理組再灌注2 h和24 h的NDS評分顯著降低(均P＜0.05)，見表1。

注:與假手術(shù)組比較，aP＜0.05;與缺血再灌注組比較，bP＜0.05;TET:漢防己甲素

2.3 腦含水量結(jié)果

缺血再灌注組再灌注24 h的腦含水量為(85.49± 0.78)%，而漢防己甲素處理組再灌注24 h的腦含水量為(82.68±0.19)%，與假手術(shù)組［(77.36±0.19)%］比較，缺血再灌注組和TET處理組的腦含水量升高(P＜0.05);與缺血再灌注組比較，TET處理組再灌注24 h的腦含水量顯著降低(P＜0.05)。

2.4 腦梗死體積結(jié)果

假手術(shù)組不存在腦梗死區(qū)域，因此腦梗死體積為0。與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和TET處理組的腦梗死體積增大(P＜0.05)。缺血再灌注組和TET處理組再灌注24 h的腦梗死體積分別為(75.1±1.2)%、(37.2±6.3)%。與缺血再灌注組比較，TET處理組再灌注24 h的腦梗死體積顯著減小(P＜0.05)。

2.5 western blot結(jié)果

與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組和TET處理組再灌注24 h缺血側(cè)大腦皮質(zhì)GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表達上調(diào)(P＜0.01);與缺血再灌注組比較，TET處理組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表達下調(diào)(P＜0.05)。見表2。

表2 三組小鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)GRP78、CHOP和caspase-12表達水平比較()

表2 三組小鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)GRP78、CHOP和caspase-12表達水平比較()

注:與假手術(shù)組比較，aP＜0.01;與缺血再灌注組比較，bP＜0.05;TET:漢防己甲素;GRP78:葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78;CHOP:C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白;caspase-12:半胱天冬酶-12

組別只數(shù)GRP78 CHOP caspase-12假手術(shù)組缺血再灌注組TET處理組15 15 15 1.52±0.16 7.45±0.24a2.75±0.16ab1.36±0.33 10.76±0.54a2.68±0.24ab1.68±0.22 9.61±0.35a1.90±0.17ab

3 討論

TET具有抗感染、降血壓、抗脂質(zhì)過氧化、逆轉(zhuǎn)心臟和血管的重塑、防止細胞受損、改善微循環(huán)及Ca2+拮抗等作用［7-10］。筆者前期研究結(jié)果表明TET具有神經(jīng)保護作用，但是具體的保護機制尚不清楚［11］。本研究顯示，腦缺血再灌注小鼠經(jīng)TET處理，再灌注后2 h和24 h時NDS評分降低，缺血側(cè)腦梗死體積百分比減少，病理學(xué)損傷減輕，提示TET處理能減輕小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷。

腦缺血再灌注后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到刺激，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)有大量錯誤蛋白蓄積，可以激活信號通路增加GRP78的轉(zhuǎn)錄，使GRP78的表達上調(diào)，引發(fā)UPR，發(fā)揮內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自身保護作用，代償不良刺激導(dǎo)致的細胞損害［12-15］。ERS引發(fā)的細胞凋亡通過激活下游的凋亡信號分子產(chǎn)生，包括CHOP和caspase-12［16-17］。CHOP是ERS特異的轉(zhuǎn)錄因子，屬C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在沒有發(fā)生ERS時表達量很低，產(chǎn)生ERS后，通過過表達誘導(dǎo)細胞凋亡。ERS引發(fā)細胞凋亡的另一個重要途徑是caspases-12途徑。caspase-12激活的主要分子機制就是鈣機制，由于caspase-12位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)胞漿面，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時，鈣大量釋放促使procaspase-12裂解，釋放出caspase-12［18］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TET作用于缺血再灌注模型，使其腦組織GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表達水平降低，推論可能是通過減輕ERS反應(yīng)來達到減輕缺血再灌注損傷的目的，起到神經(jīng)保護的作用。

本研究為TET臨床治療腦缺血再灌注損傷提供了有力的理論依據(jù)，但有關(guān)TET在炎癥、細胞凋亡等方面對腦缺血再灌注損傷的確切機制還有待進一步的深入研究。

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Effects of Tetrandrine on cerebral ischemia-reperfusion injury in mice

RUAN Lin JIN Wenxiang XU Yangying LIAN Xiaoqiang LI Li HUANG Huansen
Department of Anesthesiology,the Second Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University,Guangdong Province, Guangzhou 510260,China

ObjectiveTo investigate the protective effects of tetrandrine(TET)after mice ischemia reperfusion injury and analyze the molecular mechanism in the view of endoplasmic reticulum stress.MethodsThe male Balb/c mice were randomly divided into 3 groups:Sham group(Sgroup,n=30),Ischemia-reperfusion group(I/R group,n=30), and tetrandrine group(TET group,n=30).The pathological results were investigated by HE staining and the cerebral injury situation was evaluated by neurological deficit scores.Infract volume was measured by TTC staining,brain water content was measured by wet-dry weight method and expression of GRP78,CHOP and caspase-12 were measured by western blot.ResultsCompared with the S group,infarct volume,water content and expression of GRP78,CHOP and caspase-12 were significantly increased in I/R group and TET group(P＜0.05 or P＜0.01).Compared with the I/R group,infarct volume,water content,brain injury and expression of GRP78,CHOP and caspase-12 were significantly decreased in TET group(P＜0.05).ConclusionTET significantly alleviates focal cerebral ischem ia-reperfusion injury in mice and relates to inhibition of the endoplasmic reticulum stress and apoptosis.

Tetrandrine;Ischemia-reperfusion;Endoplasmic reticulum stress;Injury

R285

A

1673-7210(2015)03(a)-0004-03

2014-11-26本文編輯:衛(wèi)軻)

廣東省廣州市衛(wèi)生局中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合科研課題(編號20112A011038)。

阮林(1979.7-)，女，博士;研究方向:麻醉與器官保護。

黃煥森(1966.12-)，男，碩士，主任醫(yī)師;研究方向:麻醉與器官保護。