RIP1增強順鉑誘導食管癌細胞的凋亡

章余妹，吳 萍，張林杰，呂 磊，楊守梅

RIP1增強順鉑誘導食管癌細胞的凋亡

章余妹1，吳 萍1，張林杰1，呂 磊2，楊守梅2

目的 探討受體相互作用蛋白1（RIP1）增強順鉑（DDP）誘導食管癌細胞凋亡的敏感性。方法 單溶液細胞增殖分析（MTS）法檢測不同濃度DDP對食管癌細胞株KYSE510、KYSE410的增殖抑制作用；Annexin V／PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡；Western blot法檢測RIP1、半胱天冬氨酸蛋白酶3（caspase－3）、PARP的蛋白表達。結果 DDP誘導食管癌細胞凋亡具有劑量和時間相關性。凋亡率隨劑量增加和時間延長升高，RIP1蛋白的表達升高，DDP聯合RIP1特異性抑制劑處理食管癌細胞后，較敏感的KYSE510凋亡率明顯減少。結論 RIP1可能參與了DDP誘導食管癌細胞凋亡的作用。

食管癌；RIP1；順鉑；凋亡

食管癌是國內外常見的消化道惡性腫瘤之一，據統計，全球每年新發食管癌48萬例，每年約有40萬人因此死亡，我國是食管癌高發國家［1］。輔助化療是治療食管癌的一種重要手段，但其預后的改善進展卻很緩慢［2］。因此，研究增強食管癌對藥物治療敏感性的策略，發現新的治療靶點至關重要。受體相互作用蛋白1（receptor-interacting protein 1，RIP1）包含一個N末端絲氨酸／蘇氨酸激酶活性和一個C末端死亡結構域，是RIP家族中第一個被發現的成員，在調節細胞的死亡和存活方面起重要作用［3－4］。然而，目前RIP1在食管癌細胞增殖、凋亡及藥物治療敏感性方面起何種作用尚不明確。該研究以食管癌細胞株KYSE510、KYSE410為研究對象，觀察RIP1對順鉑（cisplatin，DDP）誘導的食管癌細胞凋亡的影響，并對其機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 人食管鱗癌細胞株KYSE510、KYSE410由安徽省腫瘤醫院腫瘤研究所惠贈。

1.1.2 主要試劑和儀器 RPMI1640培養基（美國Hyclone公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）；胰蛋白酶（美國Gibco公司）；DDP（5 mg／ml，江蘇豪森藥業股份有限公司）；MTS（美國Promega公司）；小鼠抗人RIP1抗體（美國BD Pharmingen公司）；兔抗人半胱天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartate specific protease 3，caspase-3）、PARP抗體（美國Santa Cruz公司）；小鼠抗人β-actin抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）；小分子抑制劑（necrostatin-1，Nec-1）（德國Calbiochem公司）；Annexin V／PI細胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博BestBio公司）；BCA蛋白定量試劑盒、Western一抗稀釋液（江蘇碧云天公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；天能全自動數碼凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 食管癌細胞株KYSE510、KYSE410采用RPMI1640培養液，含10%滅活胎牛血清，37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中培養。常規傳代，生長至對數生長期。

1.2.2MTS法檢測 取96孔細胞培養板，每孔中加100 μl含10 000個細胞的RPMI 1640培養液，在37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中培養使細胞貼壁。培養24 h后，棄去每孔培養液，換新鮮含10%胎牛血清培養液，實驗設不同濃度DDP處理組（藥物濃度為1、5、10、20、40 μg／ml）、不加DDP的空白對照組和無細胞僅培養液的凋零組。加藥后分別在24～72 h（藥物作用終點時間）終止培養，每孔加入MTS 10 μl，37℃避光孵育2 h，全自動定量繪圖酶標儀測定每孔的490 nm波長光密度（optical density，OD）值，各組重復實驗3次。

1.2.3 Annexin V／PI雙染檢測細胞凋亡 將對數生長期的細胞制成單細胞懸液接種于24孔板，每孔中每1 ml含1×105個細胞，培養24 h后，PBS洗滌2次，按實驗設計加入藥物后，收集上清液中細胞并用不含EDTA的胰酶消化法收集貼壁細胞至10 ml離心管。用冷PBS洗滌細胞2次，1 400 r／min，2～8℃，離心5 min，棄培養液，用400 μl 1×Annexin V結合液懸浮細胞，濃度約為1×106個／ml細胞。在細胞懸浮液中加入5 μl Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育15 min，加入10 μl PI染色液后輕輕混勻于2～8℃避光條件下孵育5 min。1 h內上流式細胞儀檢測，每組實驗重復3次。FCS express 4軟件分析細胞凋亡率。

1.2.4 Western blot法檢測蛋白表達 5 μg／ml DDP作用于細胞不同時間點（0、6、12、24、36 h）后，分別收集上清液中細胞并加胰酶消化收集貼壁的細胞至離心管。用PBS洗滌2次，1 500 r／min，離心10 min，棄上清液，每管加入100 μl細胞總蛋白裂解液（90 μl裂解儲存液＋10 μl苯甲基磺酰氟化物），吸至1.5 ml EP管中，冰上孵育30 min，期間不時彈EP管。以4℃14 000 r／min，離心30 min后取上清液，此即為細胞總蛋白。BCA法蛋白定量后，加入等體積的2×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸3 min使蛋白變性。取20 μg蛋白樣品在不同濃度的SDSPAGE凝膠中恒壓電泳約60 min，再轉移至硝酸纖維素膜上，轉膜約70 min，防止氣泡產生，用含質量為50 g／L脫脂奶粉的TBST封閉2 h，棄去封閉液。TBST洗滌3次，每次10 min，分別加入抗RIP1、caspase-3、PARP抗體，以β-actin為內參，4℃孵育過夜，用TBST洗3次，每次10 min，再加辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG或山羊抗兔IgG抗體，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min。ECL法顯色，照相并分析結果。每組實驗重復3次。

1.3 統計學處理采用SPSS 19.0統計軟件進行分析，計量資料以±s表示。多組均數間比較采用方差分析，兩組間均數比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 DDP對食管癌KYSE510、KYSE410細胞的增殖抑制作用KYSE510、KYSE410細胞對DDP的半數抑制濃度分別為（5.021±0.069）μg／ml、（40.169±0.302）μg／ml，差異有統計學意義（P＜0.01）；后者是前者的8倍，因此選5 μg／ml作為KYSE510和KYSE410的實驗濃度。5 μg／ml DDP作用于兩株細胞0、24、48、72 h，隨著時間的延長，KYSE510細胞存活率減少，差異有統計學意義（P＜0.01）。結果顯示，DDP誘導食管癌KYSE510、KYSE410細胞凋亡具有濃度和時間相關性，且KYSE510對DDP誘導凋亡相對敏感。見圖1。

2.2 DDP誘導食管癌KYSE510、KYSE410細胞的凋亡流式細胞儀結果顯示DDP能有效誘導食管癌細胞凋亡，隨著作用時間延長，細胞凋亡率逐漸上升。KYSE510細胞的早期凋亡率差異有統計學意義（F＝5 849.181，P＜0.01），KYSE410細胞的早期凋亡率差異也有統計學意義（F＝6 512.189，P＜0.01）。兩株細胞對DDP的敏感性不同，KYSE510比KYSE410細胞對DDP敏感，同一時間點的兩株細胞凋亡率之間進行比較，差異均有統計學意義（P＜0.01），見圖2。

2.3 RIP1在DDP處理食管癌細胞前后的蛋白表達Western blot法檢測結果顯示KYSE510細胞RIP1表達水平較KYSE410細胞高，差異有統計學意義（P＜0.01）；DDP處理前后KYSE510細胞RIP1表達水平較高，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖3、4。

2.4 caspase-3、PARP在DDP處理食管癌細胞不同時間點的蛋白表達Western blot法檢測結果顯示KYSE510細胞caspase-3、PARP活化并裂解。見圖5。

2.5 Nec-1聯合DDP處理細胞前后的凋亡流式細胞儀檢測結果顯示：對DDP較敏感的KYSE510細胞加入Nec-1后早期凋亡率減少明顯，存活率增加，差異有統計學意義（P＜0.01）。而相對不敏感的KYSE410細胞加入Nec-1后變化不明顯，差異無統計學意義。見圖6。

2.6 DDP聯合Nec-1處理細胞前后，RIP1、caspase-3、PARP的蛋白表達Western blot法檢測結果顯示DDP聯合Nec-1處理KYSE510、KYSE410細胞前后RIP1、caspase-3、PARP的蛋白表達。見圖7。

3 討論

DDP是常用的食管癌化療藥物之一，可通過產生烷化物作用于DNA，形成鏈內和鏈間交聯，破壞腫瘤細胞DNA結構和功能，啟動DNA損傷性反應和腫瘤細胞凋亡途徑的激活，導致腫瘤細胞死亡［5］。研究［5－6］表明，以DDP為基礎的化療開始療效較好，但隨著化療時間的延長、療程的增加、腫瘤細胞對DDP治療的敏感性降低或產生耐藥性，臨床療效降低。表明DDP對食管癌細胞之間存在敏感性差異。

RIP1在細胞的凋亡、程序性壞死與存活等過程中發揮了重要作用［7］。在促細胞死亡的信號轉導中，RIP1的C末端死亡結構域能與Fas、腫瘤壞死因子受體1、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體受體1、受體2、腫瘤壞死因子受體相關死亡結構域等蛋白相互作用，形成復合物，導致凋亡或程序性壞死［8］。Nec-1是RIP1的高度特異性抑制劑，通過變構抑制RIP1的活性［9］，與RIP1的N端和C端結合產生變構效應，使RIP1保持在無活性的構象［10］。抑制RIP1和相關受體相互作用，也阻止了凋亡或程序性壞死的進行［11］。Nec-1的發現能有效地明確RIP1在不同細胞的死亡類型和在疾病中的作用［12］。本研究中，DDP在兩株食管鱗癌細胞中敏感性差異大，而RIP1在兩株細胞中的表達差異也較大；加入DDP后，較敏感細胞株KYSE510的RIP1上調明顯，而相對DDP耐受的KYSE410細胞株RIP1上調不明顯，表明RIP1可能增強DDP對食管鱗癌細胞的敏感性。caspase-3是凋亡的效應分子，其活化后可導致凋亡；PARP激活后裂解，為caspases級聯反應保存能量，使caspases依賴性的凋亡能夠順利進行［13］。通過AnnexinV／PI雙染流式細胞儀檢測凋亡顯示，DDP誘導食管鱗癌凋亡隨著時間的延長凋亡率上升；加入Nec-1后，較敏感的KYSE510細胞凋亡率明顯減少，存活率增加，而相對耐受的KYSE410細胞差異不明顯。通過Western blot法檢測RIP1、caspase-3和PARP的蛋白表達，可以看出KYSE510細胞的RIP1在加入DDP后表達增強，加入DDP和Nec-1后表達減低；而KYSE410細胞則在加入DDP或DDP聯合Nec-1后無明顯變化。

綜上所述，RIP1參與DDP誘導食管癌細胞的凋亡，并且Nec-1處理后對DDP敏感的食管癌細胞株凋亡率明顯減少，RIP1的蛋白表達減低，因此RIP1可能介導了DDP誘導食管癌細胞凋亡的作用。本研究對進一步探索抗腫瘤治療及抗癌藥的耐藥性提供了一定的基礎，但其深入的分子機制還有待研究。

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RIP1 enhances DDP sensitivity of human esophageal squamous carcinoma cells

Zhang Yumei，Wu Ping，Zhang Linjie，et al
（Dept of Immunology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the role of receptor-interacting protein 1（RIP1）on the sensitivity of human esophageal squamous carcinoma cells to cisplatin（DDP）-induced apoptosis and explore a new target for clinical treatment of esophageal squamous carcinoma.MethodsThe viability of human esophageal squamous carcinoma cell lines KYSE510 and KYSE410 exposed to different concentrations of DDP were detected by CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（MTS）assay.Annexin V／PI staining was used to observe cell apoptosis in KYSE510 and KYSE410 cells.Western blot was used to detect RIP1，caspase-3，PARP expression in KYSE510 and KYSE410 cells exposed to DDP.ResultsDDP induced apoptosis in esophageal squamous carcinoma cells with dose and time dependency.Apoptotic rate was increased with dose and time，RIP1 expression was upregulated in esophageal squamous carcinoma cell lines.It was significantly reduced after exposure to DDP association special inhibitor of RIP1 in KYSE510 cells which were more sensitive to DDP than KYSE410 cells.ConclusionRIP1 maybe participates in the apoptosis of human esophageal squamous carcinoma cells to DDP，suggesting the potential of RIP1 as a new candidate target for clinical treatment of esophageal squamous carcinoma.

esophageal squamous carcinoma；RIP1；cisplatin；apoptosis

R 735.1；R 329.25

1000－1492（2015）02－0172－05

2014－10－23接收

安徽省高等學校省級自然科學研究項目（編號：KJ2011A167）

1安徽醫科大學免疫學教研室，合肥 2300322安徽省腫瘤醫院腫瘤內科，合肥 230001

章余妹，女，碩士研究生；張林杰，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：zlj33＠vip.sina.com