重度畸形精子癥患者精核蛋白表達的研究

葛 斌，楊智敏，路 健，楊名慧

（遵義醫學院附屬醫院生殖中心，貴州遵義563003）

重度畸形精子癥患者精核蛋白表達的研究

葛 斌，楊智敏，路 健，楊名慧

（遵義醫學院附屬醫院生殖中心，貴州遵義563003）

目的研究重度畸形精子癥患者精核蛋白（TNBP）含量及表達差異，為臨床治療提供理論基礎。方法2013年2月至2014年5月提取23例重度畸形精子癥患者（重度畸精組）和37例健康男性（對照組）的精液TNBP，在聚丙酰胺凝膠中電泳，經微顯像測密儀掃描以測定各蛋白條帶的相對含量。結果重度畸精組總組蛋白/總堿性蛋白（TH/TP）、1型精核蛋白/2型精核蛋白（TNBP1/TNBP2）、TP/TNBP2值顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而TNBP1/ TP值與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；精子密度顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；精液活率、前向運動率與對照組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。結論TNBP的相對含量中TNBP1/TNBP2和TP/TNBP2比值異常是導致重度畸精癥的原因之一。

精子； 先天畸形； 基因表達； 重度畸精癥； 精核蛋白

目前，男性不育發病率呈上升趨勢，近20年來人類精子數量平均每年以2%的速度下降。不育不僅影響患者的身心健康，而且還會帶來一些社會問題，因此，男性不育癥的研究已經引起全世界的高度重視[1]。最近研究發現，精子組蛋白-精核蛋白取代反應（HPRR）和精核蛋白（TNBP）的表達異常與男性不育有密切關系[2]。精子總堿性核蛋白，即TNBP有2種亞型：1型精核蛋白（TNBP1）和2型精核蛋白（TNBP2），所有哺乳動物精子內均有TNBP1，而TNBP2僅存在于人類、馬和小鼠等少數哺乳動物體內。TNBP2的表達量與人類睪丸內精子數量密切相關[2]，也有學者認為，TNBP1/TNBP2值相對于TNBP總量更能反映出人類精子質量[3]。

畸形精子癥（畸精癥）是引起男性不育的主要原因之一，指正常形態的精子數占總精子數的比例小于4%，而小于1%為重度畸精癥。重度畸精癥的病因很復雜，其中染色體異常和DNA損傷是導致畸精癥的主要原因之一[4]，最近黃茜等[5]研究發現，畸精癥患者DNA完整性顯著高于健康者。Harbuz等[6]認為，TNBP1基因SNP位點-190c-＞A多態性是引起重度畸精癥的重要原因之一，該位點多態性通過調節TNBP1的表達量來影響畸形精子的比例[7]。本研究以此為切入點，探討TNTP表達差異與重度畸精癥的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年2月至2014年5月到本中心男科實驗室行精液質量分析的患者23例，均為原發不育1年以上的重度畸精癥患者（重度畸精組），平均年齡（33.2±4.7）歲，正常形態精子小于1%，排除染色體異常、精索靜脈曲張等疾病。另選取有健康生育史男性37例為對照組，平均年齡（31.7±5.2）歲，正常形態精子大于或等于4%。

1.2 方法 兩組研究對象禁欲2～7 d，用手淫方法取出精液至廣口杯內，于37℃恒溫水浴箱內液化30 min。使用偉力全自動精子分析軟件測定精液密度、活率和前向運動精子率，形態檢查使用德國WALDECK公司生產的Testsimplets染色玻片，染色后于油鏡下計數200個精子，計算出畸精率，各參數均參照WHO男科學診斷標準。

1.2.1 提取TNBP 用高低密度洗滌液洗滌精子，離心（2 000 r/min）10 min，并調整精子密度為20×106mL-1，精液樣本用生理鹽水洗滌2次后離心（1 800 r/min）5 min，將精子沉淀溶于少量5 mol/L鹽酸胍溶液，使核解聚，隨后加入1 mol/L鹽酸溶液至終濃度為0.25 mol/L，冰浴20 min后離心（1 000 r/min）15 min，分離上清液。沉淀物再用0.25 mol/L鹽酸溶液重復抽提1次，合并2次上清液。在上清液內加入60%三氯醋酸，使終濃度為20%，冰浴25 min后離心（1 000 r/min）15 min，沉淀物用冷丙酮洗滌后離心（1 000 r/min）15 min，最后將提取的TNBP真空干燥。

1.2.2 總堿性蛋白（TP）及蛋白含量測定 在TP的丙酮干粉中加入0.2 mL蛋白溶解液、60%三氯乙酸，混合后冰浴20 min，在400 nm處比色后計算TP含量。TP中各蛋白含量測定采用Panylm-Chalkley法在聚丙酰胺凝膠中電泳，電泳膠用0.1%氨基黑染色脫色后拍攝成照片，用掃描儀掃描各蛋白條帶，測定各蛋白含量，用總組蛋白（TH）/TP和TNBP1/TNBP2值表示TNBP的相對含量。

1.2.3 觀察指標 觀察記錄兩組研究對象TNBP相對含量（TH/TP、TNBP1/TNBP2、TP/TNBP2、TNBP1/TP平均值）及精液質量參數（精子密度、活率、前向運動率）。

1.3 統計學處理 應用SPSS11.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組研究對象TNBP相對含量比較 重度畸精組患者TH/TP、TNBP1/TNBP2、TP/TNBP2平均值明顯較對照組高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而TNBP1/TP平均值與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 兩組研究對象精液質量參數比較 對照組研究對象的平均精子密度明顯高于重度畸精組，差異有統計學意義（P＞0.05）；而精子活率、前向運動率與重度畸精組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表1 兩組研究對象TNBP相對含量比較（±s）

表1 兩組研究對象TNBP相對含量比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05。

組別對照組重度畸精組n TH/TP TNBP1/TNBP2 TP/TNBP2 TNBP1/TP 37 23 0.20±0.04 2.92±1.57a0.93±0.10 2.26±0.96a2.25±0.41 4.64±1.93a0.25±0.06 0.28±0.03

表2 兩組研究對象精液質量參數比較（±s）

表2 兩組研究對象精液質量參數比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05。

組別對照組重度畸精組n 精子密度（×106mL-1） 活率（%） 前向運動率（%）66.83±14.26 8.29±2.91a37 23 55.22±19.87 60.16±21.43 45.43±17.69 47.35±16.51

3 討 論

精子形態受多種因素影響，精液白細胞、重金屬和微量元素濃度增加、空氣污染、工作環境、卵泡生成激素水平和基因突變均可能導致畸精癥[8-10]。精液中白細胞釋放的活性氧等活性產物可介導精子膜脂質過氧化，破壞精子內部結構；工作環境對精液形態也有明顯影響，本中心以往研究發現，從事電焊、裝修和釀酒等職業者精子正常形態率顯著下降，尾部卷曲精子率明顯升高；基因異常也是引起重度畸精癥的主要原因之一，目前發現的重度畸精癥相關基因有透明帶結合蛋白基因、精子成熟蛋白基因、過度蛋白基因和TNBP基因等[5]。精子形態異常包括頭部異常、頸部異常、尾部異常和細胞質小滴等，以頭部異常最為常見，表現形式為梨形頭、不定形頭和頂體缺失等，畸形精子經常出現頂體與核膜分離、雙層膜結構部分或全部消失、頂體反轉等現象，所以當精子形態異常時，就會影響到精子表面的糖基結合蛋白的結構，精子附著于卵細胞透明帶能力下降，使精子與卵子的頂體-透明帶反應發生障礙，從而精子無法穿透卵子透明帶和質膜與卵子結合受精[11]。

人類精子細胞發育過程中，TNBP逐漸取代組蛋白與DNA結合構成精子染色質，這一現象稱為HPRR，因此，TNBP是成熟精子內TP的主要組成部分，TNBP相對于TH更容易與DNA結合，它使細胞核高度濃縮，促進精子細胞由圓形變成長形，最終分化為成熟精子，對維持精子細胞核穩定有重要意義[12]，因此TNBP表達差異直接影響男性生育能力。TNBP2僅存在與人類等極少數哺乳動物中，研究發現，TNBP2的表達量和TNBP2/ TNBP1值與精子密度、活率密切相關[2]。本研究結果發現，重度畸精組患者TNBP表達總量明顯高于對照組，說明該類型患者存在HPRR障礙，而TNBP1/TNBP2值稍高于對照組，顯示TNBP表達量的下降主要表現為TNBP2表達量的減低。由此可知，TNBP表達差異與精子形態異常存在相關性。

少精癥、弱精癥和畸精癥是男性不育的主要表現形式，這3種情況經常在單個個體中同時發生，作者以前的研究也證實了這一點[13]。本次研究結果發現，重度畸精組患者的精子密度顯著低于對照組，但是活率和前向運動率與對照組無明顯差異，這與作者以前的研究結果[13]不同，分析原因應該是樣本量較少所致（上次樣本總量為386例，此次僅為60例）。

目前，治療重度畸精癥的主要方法是卵胞漿內單精子注射，此方法不但成本昂貴且增加了遺傳病垂直傳遞給子代的風險，因此，尋找安全、有效、成本低的方法治療重度畸精癥已成為最近比較熱門的研究。有學者采用中成藥治療男性少、弱、畸精癥已初見成效[10]。本研究初步探討了重度畸精癥患者TNBP的表達差異，有望對重度畸精癥的臨床治療提供理論基礎。

[1]Okada H，Tajima A，Shichiri K，et al.Genome-wide expression of azoospermia testes demonstrates a specific profile and implicates ART3 in genetic susceptibility[J].PLoS Genet，2008，4（2）：e26.

[2]王旭初.男性不育與精核蛋白的關系及中西醫治療進展[J].光明中醫，2012，27（12）：2614-2616.

[3]王旭初，潘天明.少弱精癥與精核蛋白的關系研究進展[J].現代中西醫結合雜志，2010，19（33）：4358-4360.

[4]楊雪，王碧，吳忠琴，等.163例少、弱精子癥和畸形精子癥及無精子癥患者的染色體分析[J].中國優生與遺傳雜志，2012，20（10）：49.

[5]黃茜，丘映，史秋雯，等.精子DNA損傷與精子形態、頂體完整率的關系研究[J].國際檢驗醫學雜志，2013，34（6）：649-650.

[6]Harbuz R，Zouari R，Pierre V，et al.A recurrent deletion of DPY19L2 causes infertility in man by blocking sperm head elongation and acrosome formation[J].Am J Hum Genet，2011，88（3）：351-361.

[7]余慶鋒，楊學習，李粉霞，等.PRM1基因SNP位點-190C-＞A多態性對精子畸形率的影響[J].中華男科學雜志，2012，18（4）：314-317.

[8]Brahem S，Mehdi M，Elghezal H，et al.Detection of DNA frag mentation and meiotic segregation in human with isolatedteratozoospermia[J].J Assist Reprod Genet，2011，28（1）：41-48.

[9]劉富新，蘇大林，郝愛軍，等.精漿各微量元素含量對精子形態的影響[J].國際檢驗醫學雜志，2012，33（8）：912-913.

[10]徐潘，陳盛鐿，謝作剛.畸形精子癥研究進展[J].浙江中西醫結合雜志，2014，24（5）：474-476.

[11]潘家坪，陳智勤，王羽，等.精子形態與體外受精中受精率的關系[J].診斷學理論與實踐，2012，11（3）：249-251.

[12]陳松，曹堅，費仁仁，等.弱精子癥患者精核蛋白含量的分析[J].中華男科學雜志，2005，11（8）：587-589.

[13]葛斌，譚兵兵，譚曉珊，等.精子形態與精子活力活率的關系[J].現代醫藥衛生，2008，24（21）：3176-3177.

Protamine expression in severe teratozoospermia patients

Ge Bin，Yang Zhimin，Lu Jian，Yang Minghui
（Reproductive Center，Affiliated Hospital of Zunyi Medical College，Guizhou，Zunyi 563003，China）

ObjectiveTo investigate the difference of content and expression of protamine（TNBP）in the severe teratozoospermia patients and provide the theoretical basis.MethodsIt was extracted TNBP of semen protamine from 23 severe teratozoospermia patients（the severe teratozoospermia group）and 37 healthy men（the control group）from Feruary 2013 to May 2014 with polyacrylamide gelelectrophoresis and then confirm the relative content of proein bands scanned by micro imaging density measuring instrument under the cataphoresis in the polyacrylamide hydrogel.ResultsThe value of TH/TP，TNBP1/TNBP2，TP/ TNBP2 in the evere teratozoospermia group were significantly higher than those of the control group（P＜0.05）.Compared with the control group，there was no significant difference in TNBP1/TP value（P＞0.05）.Thesperm density was lower than that of the control group（P＜0.05）.Both the sperm survival rate and the precession movement rate showed no significant difference with the control group（P＞0.05）.ConclusionThe abnormity of TNBP1/TNBP2，TP/TNBP2 in the relative content of TNBP is one of the reasons leading to severe teratozoospermia.

Spermatozoa； Congenital abnormalities； Gene expression； Severe abnormal azoospermia； Protamine

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.06.007

：A

：1009-5519（2015）06-0818-02

2014-10-29）

遵義醫學院碩士啟動基金（院字2007-54號）。

葛斌（1981-），男，安徽渦陽人，碩士研究生，主要從事分子遺傳學方面的研究；E-mail：38248866@qq.com。