石榴皮醇提物對(duì)胃癌SCG-7901細(xì)胞增殖的影響

孫澤敏，徐先林，歐剛衛(wèi)（遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，貴州遵義563099）

石榴皮醇提物對(duì)胃癌SCG-7901細(xì)胞增殖的影響

孫澤敏，徐先林，歐剛衛(wèi)（遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，貴州遵義563099）

目的探討石榴皮醇提物對(duì)胃癌SCG-7901細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人胃癌SCG-7901細(xì)胞。制備石榴皮醇提物，藥物最終濃度為100、80、60、40、20、10 μg/mL，并設(shè)置不加藥的陰性對(duì)照組（0 μg/mL），采用四唑鹽法、集落形成試驗(yàn)觀察比較石榴皮醇提物對(duì)SCG-7901細(xì)胞增殖和克隆形成能力的影響；采用倒置顯微鏡觀察提取物作用細(xì)胞48 h后的形態(tài)變化；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)提取物作用48 h后細(xì)胞周期的變化。結(jié)果石榴皮醇提物對(duì)SCG-7901細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，呈劑量依賴性；且石榴皮醇提物顯著抑制SCG-7901細(xì)胞集落形成率。不同濃度的藥物作用后，SCG-7901細(xì)胞數(shù)目減少，部分細(xì)胞死亡，細(xì)胞核固縮；細(xì)胞周期發(fā)生改變，與陰性對(duì)照組比較，S期細(xì)胞比例減少，G0/G1期細(xì)胞增多，出現(xiàn)明顯G0/G1期阻滯。結(jié)論石榴皮醇提物可以抑制胃癌SCG-7901細(xì)胞增殖，干擾細(xì)胞G1期向S期轉(zhuǎn)化。

石榴皮/化學(xué)； 醇類/藥理學(xué)； 胃腫瘤； 細(xì)胞增殖

石榴（Punica granatum L.）屬于石榴科石榴屬落葉灌木或小喬木，原產(chǎn)于伊朗及阿富汗等中亞地區(qū)。目前在我國(guó)陜西臨潼、山東棗莊、河南開封、安徽懷遠(yuǎn)、四川會(huì)理、云南蒙自和新疆等地均有一定規(guī)模的石榴適生栽培區(qū)[1]。在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥中主要用于久瀉、出血、蛔蟲等病癥[2]。石榴皮是石榴的干燥果皮，其成分復(fù)雜多樣，含鞣質(zhì)、黃酮類、石榴皮堿、異槲皮苷、樹脂、甘露醇、沒食子酸等，并含多種氨基酸和多種微量元素[3-4]。近年來，隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)石榴藥理研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)石榴具有抗菌、抗病毒、抗氧化、調(diào)血脂、降血壓及免疫調(diào)節(jié)等作用[5]。其中抗腫瘤作用尤其受到重視，國(guó)外Ordoudi等[6]曾報(bào)道液態(tài)石榴皮萃取物可以抑制人體Burkitt淋巴瘤細(xì)胞的Raji和P3-HR1細(xì)胞群生長(zhǎng)，并促進(jìn)其凋亡；石榴籽還可以預(yù)防肝癌和抑制肝癌的轉(zhuǎn)移[7]。國(guó)內(nèi)研究也報(bào)道了石榴皮正丁醇提取物可以抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)[8]；石榴皮鞣花酸可明顯抑制4T1細(xì)胞增殖誘導(dǎo)其凋亡，誘導(dǎo)并提高荷瘤小鼠特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)[9]。但是目前國(guó)內(nèi)關(guān)于石榴皮提取物抗胃部腫瘤作用的藥理研究較少。本文采用醇提法提取石榴皮中有效成分，以人胃癌細(xì)胞株SCG-7901作為研究對(duì)象，應(yīng)用四唑鹽（MTT）試驗(yàn)、集落形成試驗(yàn)、光鏡、流式細(xì)胞儀等方法研究其對(duì)人胃癌SCG-7901細(xì)胞增殖的影響，并初步探討其機(jī)制，希望為石榴皮的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與試劑 石榴皮（貴州省藥材公司，產(chǎn)地：貴州）、RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）、胎牛血清（杭州四季青科技有限公司）、胰蛋白酶（美國(guó)Amresco公司）、MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）、吉姆薩染料（北京諾博萊德科技有限公司）、細(xì)胞周期試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司），其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），CO2培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀、冷凍干燥機(jī)（美國(guó)Thermo公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.1.3 細(xì)胞 人胃癌細(xì)胞株SCG-7901，購(gòu)自中國(guó)細(xì)胞庫(kù)典藏細(xì)胞中心，并由本教研室凍存，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 石榴皮醇提物的制備 將石榴皮粉碎，過60目篩，5倍體積乙醇50℃回流提取3次，每次2 h。合并提取液，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，冷凍干燥成粉末。使用前用培養(yǎng)基溶解并稀釋至所需藥物濃度。

1.2.2 MTT試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，完全培養(yǎng)基重懸、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升8×104個(gè)，接種至96孔板，每孔100μL。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。加入不同濃度的提取物20 μL，使其終濃度分別為100、80、60、40、20、10μg/mL，同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照組0μg/mL（即只加細(xì)胞，不加藥）。每組5個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，取出培養(yǎng)板，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。然后每孔加入100 μL Formanzan溶解液，平板搖床振搖5 min，使結(jié)晶紫顆粒溶解。于酶標(biāo)儀的570 nm處測(cè)定吸光度。按下列公式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率：抑制率（%）=（A陰性對(duì)照組-A試驗(yàn)組）/A陰性對(duì)照組×100%。

1.2.3 集落形成試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，完全培養(yǎng)基重懸、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升200個(gè)，接種至6個(gè)空孔板，每孔1 mL。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入不同濃度的提取物1 mL，使其終濃度為100、80、60、40、20、10 μg/mL，同時(shí)設(shè)定不加藥的陰性對(duì)照組0 μg/mL。每組3個(gè)重復(fù)。每2天更換含藥培養(yǎng)基1次，連續(xù)培養(yǎng)10 d。小心棄去培養(yǎng)基，甲醇固定5 min，加入新鮮配制的吉姆薩染料1 mL。室溫染色20 min，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗去多余的染料，晾干后鏡檢（100×）。計(jì)算克隆形成率（%）=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種至25 mL培養(yǎng)瓶中，每瓶4 mL。培養(yǎng)12 h，加入不同濃度的提取物4mL。同時(shí)設(shè)定不加藥的陰性對(duì)照組0 μg/mL。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)變化情況。

1.2.5 細(xì)胞周期試驗(yàn) 將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升8 000個(gè)，接種至25 mL培養(yǎng)瓶中，每瓶4 mL。培養(yǎng)12 h。加入不同濃度的提取物4 mL，同時(shí)設(shè)定不加藥的陰性對(duì)照組0 μg/mL。48 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的70%乙醇固定。按照細(xì)胞周期試劑盒染色，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的分布情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Sigmaplot 12.5軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 石榴皮醇提物對(duì)SCG-7901細(xì)胞增殖的影響 提取物在10～100 μg/mL濃度內(nèi)可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系，抑制率分別為10.21%、18.67%、32.35%、41.28%、61.85%、75.27%。以提取物濃度為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo)作回歸曲線，回歸方程為：Y=0.714X+ 3.043，R2=0.99，半數(shù)抑制率（IC50）為66 μg/mL，見圖1。

圖1 石榴皮醇提物對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的影響

圖2 石榴皮醇提物對(duì)SGC-7901克隆形成率的影響

2.2 石榴皮醇提物對(duì)SCG-7901細(xì)胞克隆形成的影響 不加藥物時(shí)（即陰性對(duì)照組0 μg/mL），克隆形成能力較強(qiáng)，為65%。提取物在10～100 μg/mL濃度內(nèi)，隨著藥物濃度的增加，克隆數(shù)減少，克隆能力減弱，抑制細(xì)胞克隆的形成。藥物濃度在100、80、60、40、20、10 μg/mL時(shí)的克隆形成率（52.34%、43.38%、39.57%、25.40%、19.02%、16.21%）與陰性對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 石榴皮醇提物對(duì)SCG-7901細(xì)胞形態(tài)的影響 陰性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)飽滿，貼壁明顯，折光性強(qiáng)，見圖3A。細(xì)胞經(jīng)1/2 IC50（33 μg/mL）和IC50（66 μg/mL）的提取物處理48 h以后，細(xì)胞數(shù)目銳減，細(xì)胞間連接減少，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞壞死，大部分細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中，見圖3B、3C。

圖3 石榴皮醇提取物對(duì)SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的影響（100×）

2.4 石榴皮醇提物對(duì)SCG-7901細(xì)胞周期的影響 細(xì)胞經(jīng)1/2 IC50（33 μg/mL）和IC50（66 μg/mL）石榴皮醇提物處理48 h后與陰性對(duì)照組比較，G0/G1期細(xì)胞隨著藥物濃度的增大而增多，相應(yīng)的S和G2/M期細(xì)胞減少，出現(xiàn)明顯的G0/G1阻滯。各時(shí)期DNA含量與陰性對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖3。

表1 各組不同時(shí)期DNA含量比較（±s，%）

表1 各組不同時(shí)期DNA含量比較（±s，%）

注：與陰性對(duì)照組比較，aP＜0.05。

組別陰性對(duì)照組（0 μg/mL）1/2IC50組（33 μg/mL）IC50組（66 μg/mL）G0/G1 S G2/M 54.61±1.35 65.80±2.33a78.40±2.51a28.60±2.81 21.64±4.29a12.46±1.73a16.82±2.24 12.55±3.12a9.11±1.78a

圖3 石榴皮醇提物對(duì)SGC-7901細(xì)胞周期的影響

3 討 論

癌癥是一種死亡率極高、嚴(yán)重威脅人類生命與健康的疾病，是全世界科學(xué)家長(zhǎng)期以來最想攻克的難題之一[10]。WHO在2014年初發(fā)布的《世界癌癥報(bào)告》中指出，2012年有1 400萬(wàn)人被診斷患癌，預(yù)測(cè)到2035年這個(gè)數(shù)據(jù)將增至2 400萬(wàn)，且40歲以后的發(fā)病率和病死率呈快速上升趨勢(shì)，而胃癌的病死率居前3位[11]，因此，胃癌的研究已經(jīng)成為目前的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。

本研究采用MTT方法檢測(cè)石榴皮醇提物對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，其IC50為66μg/mL，且隨著石榴皮醇提物濃度的增加抑制率逐漸上升，說明這種抑制作用具有一定的劑量依賴性；同時(shí)，集落形成試驗(yàn)也證明石榴皮醇提物具有抑制腫瘤細(xì)胞克隆形成的能力，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，隨著石榴皮醇提物濃度的增加克隆形成數(shù)減少，具有一定的劑量依賴性。細(xì)胞經(jīng)1/2 IC50和IC50石榴皮醇提物處理48 h后，光鏡下觀察到細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞體積變圓，細(xì)胞核變小，有大量細(xì)胞碎片漂浮于培養(yǎng)液中。流式細(xì)胞儀檢測(cè)提取物對(duì)細(xì)胞周期的影響與陰性對(duì)照組比較，細(xì)胞被阻滯于G0/G1期，這有可能阻斷了細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂，延長(zhǎng)了細(xì)胞周期，從而起到抑制細(xì)胞增殖的作用[12]。

綜上所述，石榴皮醇提物對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞具有明顯的抑制作用，為接下來從醇提物中尋找具有高選擇性、低毒性的化合物奠定了一定基礎(chǔ)，為石榴皮的進(jìn)一步開發(fā)與研究提供了一定的藥理學(xué)依據(jù)。

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Effect of pomegranate peel granatoline extracts on proliferation of gastric cancer SGC-7901 cells

Sun Zemin，Xu Xianlin，Ou Gangwei
（Department of Biochemistry，Zunyi Medical University，Guizhou，Zunyi 563099，China）

ObjectiveTo approach the effect of pomegranate peel granatoline extracts on proliferation of gastric cancer SGC-7901 cells and its anti-cancer mechanisms.MethodsThe gastric cancer SCG-7901 cells were cultured in vitro and the pomegranate peel granatoline was prepared whose final concentration was 100，80，60，40，20，10 μg/mL respectively.Another negative control group was set up without given medicine（0 μg/mL）.It adopted MTT and cloning assays to observe and compare the effect of pomegranate peel granatoline of on proliferation and cloning capabilities of gastric cancer SGC-7901 cells.The morphologic changes of SCG-7901 cells acted by extracts for 48 hours were observed by inverted phase contrast microscope.The periodicvariationof SCG-7901cellstreated with extractsfor 48 hourswereanalyzed by flow cytometry（FCM）.ResultsThe pomegranate peel granatoline extracts displayed obvious inhibition effect on SCG-7901 cells，being distinctive concentration-dependent and time-dependent，and it significantly inhibited the formation rate of cells colony.Acted by different-concentration extract solution，the SCG-7901 cell numbers decreased with death of partial cells and karyopy knosis as well as the cell cycle changed.Compared with the negative control group，the ratio of S-phase cells was decreased and G0/G1-phase increased，as well as an obvious block in G0/G1phase.ConclusionThe pomegranate peel granatoline extracts may inhibit the proliferation of gastric cancer SGC-7901 cells，preventing the cells from G1phase to S phase.

Pericarpium Granati/chemistry； Alcohols/pharmacology； Stomach Neoplasms； Cell Proliferation

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.06.010

：A

：1009-5519（2015）06-0826-03

2014-10-30）

貴州省科技廳基金項(xiàng)目（C-487）。

孫澤敏（1982-），女，貴州遵義人，碩士研究生，主要從事胃腸道腫瘤研究；E-mail：sunzeminzunyi@163.com。

歐剛衛(wèi)（E-mail：gangwei.ou@zmc.edu.cn）。