苦馬豆外植體初代培養雜菌污染率控制的探討

郭 剛， 朱妍梅， 付習科， 石 強

(新疆農業職業技術學院，新疆昌吉 831100)

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苦馬豆外植體初代培養雜菌污染率控制的探討

郭 剛， 朱妍梅*， 付習科， 石 強

(新疆農業職業技術學院，新疆昌吉 831100)

[目的]以苦馬豆種子和發芽幼苗的不同部位作為外植體進行無菌處理和培養，探究雜菌污染率控制的方法。[方法]以MS 為基本培養基，通過不同消毒試劑種類和濃度配比、時間，探討其對外植體初代培養污染率的影響。[結果] 野生苦馬豆種子去皮后采用0.1%升汞消毒效果較好，消毒時間以6 min為佳；苦馬豆幼苗胚軸最佳消毒時間為6 min；外植體表面滅菌后使用50 mg/L的青霉素溶液處理30 min效果最為理想。[結論]篩選獲得適宜的外植體消毒方法，對細菌和真菌的抑制作用提供一條有效的途徑，為提高苦馬豆組培體系工廠化育苗的效率奠定基礎。

苦馬豆；初代培養； 外植體；污染率

苦馬豆[Swainsonasalsula(Pall.) DC]隸屬豆科苦馬豆屬植物，別名羊尿泡，屬多年生草本或小喬木，我國僅有一屬一種，主要分布于我國西北地區，以全草、根、果實入藥，具有利尿、消腫、降壓等功效[1-4]。近年來，由于過度放牧、過度農墾和不合理采集地下水資源等導致土地沙漠化，生態環境 日益惡化，植被遭到破壞，野生苦馬豆數量急劇下降，苦馬豆資源日趨匱乏。因此，建立苦馬豆人工繁殖技術，可改變傳統的繁殖系數小、用種量大、生產成本高的育苗方式，從而實現苦馬豆繁育的良種化、標準化和規模化，同時能夠快速供苗，降低種苗成本，提高資源利用效益，保持苦馬豆資源可持續利用[5]。

在建立苦馬豆快繁體系時,外植體來自田間，植物材料表面不僅附著大量微生物而且可能攜帶有內生菌。因此植物組織培養無菌體系的建立必須經過初代外植體消毒這個重要環節。在以苦馬豆種子為基礎建立外植體再生體系，對外源與內源雜菌消毒與污染控制的研究尚未見報道。為了提高苦馬豆組織培養壯苗率，筆者在外植體初代篩選培養中，采用不同消毒試劑和消毒方法處理材料，并探討抗生素是否會對外植體生長發育產生影響。

1 材料與方法

1.1 材料野生苦馬豆干種子(采集于新疆昌吉市六工鎮田間)，經浸泡處理，剝去種皮，放于墊濕潤濾紙的培養皿中，在23 ℃恒溫培養箱中培養，生長至5～6 cm 幼苗，取葉柄、胚軸、子葉切段作為試驗材料，開展外植體抑菌試驗。

1.2 統計方法

(1)萌發率=(發芽種子數/種子總數)×100%；(2)污染率=(污染數/接種總數)×100；(3)未污染率=(未污染數/接種總數)×100%。

2 結果與分析

2.1 不同消毒方法對苦馬豆種子萌發的影響經1 g/L升汞與1 g/L次氯酸鈉消毒處理后，發現升汞消毒效果較好，消毒時間以6 min為佳。盡管未去種皮種子在1 g/L升汞處理6 min下，污染率顯著下降，但尚未完全得到無菌幼苗，即無菌體系還不能完全保證。但將種子進行去果皮處理后發現，發芽率明顯提高，污染率降到最低(表1)。

2.2 不同0.1%升汞消毒時間對不同外植體的影響雖然不同外植體最佳消毒時間有所不同，但在0.1%升汞處理下，所有外植體的污染率在一定時間范圍內均隨消毒時間增加而降低，但消毒時間過長會造成毒害，致使外植體因損傷而死亡。從表2可以看出，采用0.1%升汞處理不同外植體，幼嫩葉柄的最佳消毒時間為5 min，當時間超過5 min時，未污染率達100%，但成活率僅為30%；胚軸最佳消毒時間為6 min，其次為5 min，而7 min時成活率僅為30%，明顯下降；葉片的最佳消毒時間為5 min，其次為4 min，超過5 min將導致成活數下降，可見，當消毒時間較短時消毒效果不佳，而太長又會損壞材料，直接影響其成活。因此，在對材料進行表面消毒處理時，時間控制是關鍵因素。

2.3 抗生素抑菌效果采用2 種常見抗生素(慶大霉素和青霉素)研究其對初代苦馬豆外植體培養中污染菌的抑制作用， 并探討是否對苦馬豆外植體生長發育產生影響。

由表3可知，在外植體表面滅菌前使用抗生素的抑菌效果并不理想，5 mg/L青霉素溶液處理24 h時，被感染的外植體數均比使用慶大霉素2個處理低。但外植體表面消毒后使用50 mg/L抗生素溶液處理30 min效果最為理想，且青霉素的抑菌效果比慶大霉素好。使用這2種處理后，在以后的繼代、分化與生長過程中均未發現對植株有致毒作用，外植體發育正常。

表1 不同消毒劑處理對不同類型種子萌發率和污染率的影響 %

表2 不同0.1%升汞消毒時間對不同外植體的影響

表3 不同抗生素處理對不同外植體污染率的影響 %

3 結論與討論

建立無菌繁殖體系，是植物組織培養的首要步驟。初代外植體篩選，表面微生物的污染一般容易控制。該試驗中，苦馬豆種子去種皮處理后發現,在0.1%升汞處理6 min,發芽率達到95%，樣本污染率降到最低為2%，采用0.1%升汞分別處理初代外植體葉柄、胚軸、子葉5、6、5 min后，污染率和成活率均達到最佳控制狀態。

在植物組織培養研究或規模化生產過程中，微生物特別是內生菌污染，是導致試管材料死亡的最主要原因。在苦馬豆頂芽誘導培養試驗中發現，培養2～3代后，培養基中出現“絲狀物”污染，說明苦馬豆帶有較多的內生菌，經外植體表面滅菌后，通常很難將其殺滅，致使組織培養過程中出現較高的污染率。

目前，對內生菌防治最有效的辦法是使用抗生素[6-7]。研究表明，直接在培養基中加入抗生素能有效控制這類污染，但這種處理對植物具有致毒作用并延緩其生長[8]。且長時間的使用不但會使內生菌的抗藥性增強，而且會使植物對藥物的依賴性加強[9]，如Leifert等[10]在培養基中加入抗生素，飛燕草的增殖和生根都受到阻緩。

該試驗采用青霉素與慶大霉素2種抗生素溶液，分別在苦馬豆外植體表面滅菌前和表面滅菌后使用，結果發現，抗生素溶液在表面滅菌后使用比向培養基中加入抗生素更方便，且對植物無明顯的致毒作用。同時采用抗生素溶液在表面滅菌后浸泡外植體則較省時、簡便，為后期外植體繼代培養提供大量無菌材料奠定基礎。此種處理方法與牟會斌[11]在微型月季微繁體系的構建及織培生根機理研究中所得結果相似。

植物組織培養中全部殺死植物表面和組織中的微生物，一般的消毒方法無法完成。內源菌則較難控制，目前除利用抗生素外，還可通過先對外植體植物進行預栽管理、外植體的預處理。在此基礎上，改進消毒方法(如真空減壓法、酸化培養基、灼燒法等)，均能降低由內源菌引起的污染[12]。

[1] 馬金雙.關于苦馬豆屬學名的討論[J].云南植物研究，1991，13(4):380-382.

[2]王進，王桔紅，張勇，等.苦豆子和苦馬豆種子特性及硬實破除研究[J].中藥材，2011， 34(5)：670 -673.

[3] 周吉林，伍春蓮，陳衛英.光照及黑暗條件下不同濃度2，4-D 對誘導苦馬豆愈傷組織的影響[J].內江師范學院學報，2009，24(12)：41 -44.

[4] 崔小蓉，劉慧，楊軍.鈣鹽脅迫下苦馬豆愈傷組織生理指標研究[J] .西華師范大學學報：自然科學版，2011，32(3)：259 -263.

[5] 郭剛，盧躍敏，張曉宏等.苦馬豆的組織培養與快速繁殖[J].新疆農業科學，2014， 51(1)：118 -123.

[6] 李海航，潘瑞熾.青霉素在高等植物中的應用[J].植物生理學通訊，1987(5):1.

[7] SKIRVIN R M，CHU M C，YOUNG H J.Rose[M]//AMMIRATIOSHARP W R,EVAN S D A，BAJAJ YP S，et al.Handbook of Plant cellculture.VoI 5(ornamental species).New York:McGaw-Hill,1990:716-743.

[8] DODDS J R,ROBERTS L W.Some inhibitory effects of gentamycin on plant tissue cultures[J].In Vitro,1981,17: 467-470.

[9] FALKINER F R.Strategy for the selection of antibiotics for use against common bacterial pathogens and endophytes of plants[J].Acta Hort,1988,225:53-56.

[10] LEIFERT C,MORRIS C,WATIES W M.Effect of conmbinations of antibiotics micropropagated clematis,Delphinniu,Hosta,Iris and Photinia[J].Plant Cell Tissue Organ Culture,1992,29:153-160.

[11] 牟會斌.微型月季微繁體系的構建及組培生根機理研[D].南京：南京農業大學， 2001.

[12] 曹青爽，黃閩敏，李萍.植物組織培養中的污染控制[J].農村科技，2009(6):55-56.

Control on Bacterial Contamination ofSwainsonasalsulaExplant Cultures

GUO Gang, ZHU Yan-mei*, FU Xi-ke et al

(Xinjiang Vocational College of Agriculture, Changji,Xinjiang 831100)

[Objective] WithSwainsonasalsulaseeds and different parts of seedlings as explants, aseptic processing and culture was conducted, methods to control the rate of bacterial contamination were explored.[Method] Using MS as basic medium, through different types and concentrations of disinfection reagent ratio, time, the effects on explant primary culture contamination rate were discussed.[Result] The results showed that the seeds of wild salsula peeled with 0.1% mercuric chloride is better, better disinfection time 6 min; Explants after surface sterilized using 50 mg/L penicillin solution for 30 min has ideal treatment effect.[Conclusion] The suitable explant disinfection methods were obtained, which will provide an effective way for the inhibition of bacteria and fungi, lay the foundation for improving the tissue culture system salsula industrialized breeding efficiency.

Swainsonasalsula; Primary culture; Explants; Contamination rate

郭剛(1977- )，男，河南南陽人，講師，碩士，從事藥用植物資源開發與抗逆生理研究。*通訊作者，教授，碩士，從事植物病蟲害鑒別與防治研究。

2015-02-11

S 188

A

0517-6611(2015)09-028-02