篤斯越橘新品種“紫水晶”離體培養關鍵技術研究

田新華, 翁海龍, 李 京, 邢亞娟

(黑龍江省林業科學研究所，黑龍江哈爾濱 150081)

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篤斯越橘新品種“紫水晶”離體培養關鍵技術研究

田新華, 翁海龍, 李 京, 邢亞娟*

(黑龍江省林業科學研究所，黑龍江哈爾濱 150081)

[目的]探討篤斯越橘新品種“紫水晶”離體培養的關鍵技術。[方法]通過對外植體滅菌方法，取材時期，增殖、壯苗、生根培養的篩選與優化，建立適合篤斯越橘新品種“紫水晶”的無性配套繁殖體系。[結果]外植體滅菌采用0.1% HgCI2消毒3 min；WPM(改良)+6-BA 1.0 mg/L+ZT1.0 mg/L為篤斯越橘新品種“紫水晶”分化增殖培養基；9月份將無根試管苗移栽到混配有機基質鋸末∶樹皮∶草炭=1∶1∶1基質中，空氣相對濕度80%～90%，培養溫度為20～25 ℃，50 d后生根率達72.4%。[結論]建立了篤斯越橘新品種“紫水晶”離體培養關鍵技術，為大規模工廠化育苗提供技術支持。

篤斯越橘；紫水晶；離體培養；條件優化

篤斯越橘新品種“紫水晶”是以野生篤斯越橘為母本，北美藍莓為父本的雜交品種，2014年12月鑒定的新品種。該品種樹體高大，成年樹高0.5～0.8 m，結實量1 200 kg/hm2，總狀花序，果實藍紫色，適合加工，百粒重約60 g。與國外同類品種對比，具有抗旱抗寒優勢，定植1年成園，第2年達到豐產。適宜種植在大興安嶺-黑河-小興安嶺一線，活動積溫在2 300 ℃以下。

目前，國內對于篤斯越橘的應用與新品種的選育研究較少，而篤斯越橘的離體培養體系尚未建立，組培苗移栽存活率仍較低[1-4]，不利于新品種的規模化生產與推廣應用。因此，筆者對新品種“紫水晶”的配套繁育技術進行研究，以期為大規模工廠化育苗提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料選用“紫水晶”休眠枝條為供試材料，用清水浸泡催芽，每2 d換1次水，水溫控制在18～20 ℃，7 d左右休眠枝條開始萌芽。

1.2 試驗方法

1.2.1外植體滅菌。腋芽萌發后，剪取長約1.0 cm的帶芽莖段，用清水反復沖洗。在超凈工作臺上進行滅菌處理：①75%乙醇浸泡30 s，0.1%HgCI2浸泡3 min，然后用無菌水沖洗3次；②75%乙醇浸泡30 s，0.1% HgCI2浸泡5 min，用無菌水沖洗3次；③0.1% HgCI2浸泡3 min，之后用無菌水沖洗3次；④0.1% HgCI2浸泡5 min，用無菌水沖洗3次；⑤75%乙醇浸泡30 s，5%次氯酸鈉浸泡5 min，用無菌水沖洗3次；⑥75%乙醇浸泡30 s，5%次氯酸鈉浸泡10 min，用無菌水沖洗3次。以上材料滅菌后取出，用無菌濾紙吸干表面多余水分。每組處理10個莖段，3次重復，5 d后觀察效果。

1.2.2取材時期及芽苗生長狀況。于4月采集健壯無病的“紫水晶”休眠枝條，采用水培催芽的方式，將突破芽鱗的嫩芽接種于改良WPM[用Ca(NO3)2·4H2O，KNO3代替原WPM培養基中的CaCl2、K2SO4]；7月、10月分別采集當年生單芽莖段接種，接種后7、14、21 d分別觀察染菌情況,研究不同接種時間對芽苗長勢的影響。培養基中添加蔗糖30 g/L，日產瓊脂粉6 g/L，pH調至5.8，培養溫度白天(25±1)℃，夜間(20±1)℃，光照強度2 000 lx，光照時間12 h/d。

1.2.3誘導側芽生長。以改良的WPM培養基[用Ca(NO3)2·4H2O，KNO3代替原WPM培養基中的CaCl2、K2SO4]為基本培養基，在無菌條件下將單芽莖段接種于WPM(改良)+ZT 0.5 mg/L +30 g/L蔗糖+瓊脂粉6 g/L培養基上誘導芽苗生長。培養條件同“1.2.2”。

1.2.4試管苗分化增殖培養。待莖段腋芽伸長后，分別轉接于以改良WPM為基本培養基，以6-芐基腺嘌呤(6-BA)，玉米素(ZT)為2個因素，每因素設置3個水平。采用L9(34)正交試驗設計進行芽增殖培養基篩選。每個處理2次重復，每個重復接種10瓶，35 d后調查苗高和苗數。

1.2.5篤斯越橘壯苗培養。篤斯越橘的試管苗相對柔嫩纖細，需進行一段時間的壯苗培養，才能誘導生根。剪取長約1.0 cm的試管苗轉接于WPM(改良)+ZT 1.0 mg/L+30 g/L蔗糖液體培養基，分別置于2 000 lx(處理①)、3 000 lx(處理②)的光照條件下培養50 d。每個處理2次重復，每個重復接種10瓶，培養50 d后調查苗高、莖粗、分化增殖倍數、生長狀況。

1.2.6試管苗瓶外生根培養。

1.2.6.1不同有機基質對篤斯越橘苗瓶外生根的影響。經發酵腐熟處理的有機基質經飽和KMnO4溶液消毒30 min后，大量清水沖洗，塑料薄膜覆蓋陽光暴曬24 h以上，通風備用。供試基質：①草炭+稻殼+樹皮=1∶1∶1;②針葉+樹皮+闊葉=1∶1∶1;③針葉+闊葉+稻殼=1∶1∶1； ④樹皮+闊葉=1∶1;⑤鋸末+樹皮+草炭=1∶1∶1；⑥草腐菌菌糠+樹皮=1∶1。

將經過壯苗培養的芽苗扦插于以下6種有機基質，每個處理扦插20株，重復3次，30 d后統計不同基質中篤斯越橘試管苗存活率，篩選出適宜篤斯越橘生根的移栽基質。

1.2.6.2不同激素濃度對篤斯越橘組培苗移栽的影響。選用第⑤、⑥號基質為栽培基質，將無根組培苗分別蘸取ABT 500、1 000 mg/L，速蘸30 s后移栽在基質中，50 d后分析不同激素處理對篤斯越橘試管苗瓶外生根的影響。

1.2.6.3不同濕度條件對篤斯越橘瓶外生根的影響。將篤斯越橘移栽培養的溫度控制在白天(20～25)℃，夜間(10～15)℃，針對移栽培養不同濕度進行試驗，篩選出適于誘導苗生根的環境條件。

1.2.6.4不同移栽時間對篤斯越橘試管苗瓶外生根的影響。選用第⑤、⑥號基質為栽培基質，將組培苗分別蘸取ABT 500、1 000 mg/L，速蘸30 s，分別在5、7、9月進行移栽試驗，30 d后統計存活率，分析最適宜篤斯越橘試管苗移栽的時間。

1.3 數據處理采用Microsoft Excel 2003統計工具進行計算并作圖，DPS 7.05數據統計軟件對試驗數據進行方差分析和差異顯著性測驗(SSR法)[5]。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌方法的滅菌效果由表1可知，處理⑤、⑥滅菌不充分，污染率超過60.0%；處理①、②、④滅菌過度，大部分外植體切口處出現褐化，盡管污染數少，但苗木褐化較嚴重，己經影響到苗木正常生長；處理③即用0.1%升汞浸泡3 min，之后用無菌水沖洗3次的滅菌方法，污染率為16.7%，褐化率為13.3%，為較適宜的滅菌方法，既能達到滅菌的目的，又對外植體無損傷。

表1 不同滅菌時間的滅菌效果

2.2 不同取材時期對篤斯越橘芽苗生長的影響分別于第2年3、7、10月進行篤斯越橘外植體的接種，于接種后7、14、21 d觀察結果發現，取材于不同時期的芽，分化率和嫩梢伸長都有所差異。3月接種的嫩芽相對染菌率低，同時由于經過冬季休眠，營養的累積，自身調節已處于萌動期，春季接種的芽苗生長勢強，生長速度較快，初分化天數早，在接種的第8天就開始分化。7月接種的芽染菌較嚴重，向高生長速度快，節間距離大，葉片大而薄，多汁，易產生玻璃化現象，分化相對較少，苗木較細弱。10月接種的芽啟動生長速度慢，甚至停滯，從接種的16 d開始有分化跡象。

2.3 篤斯越橘側芽生長情況篤斯越橘腋芽在改良后的初代培養基上培養10 d左右開始萌動，培養15 d后節間伸長、葉片展開，培養25 d后繁殖系數較高(平均新生芽苗數4.7個)，葉片較多(平均葉片數6.0枚)，芽苗生長速度較快(平均新生芽苗高0.67 cm)，平均芽苗高1.54 cm。

2.4 篤斯越橘試管苗增殖培養基的篩選將經初代培養的試管苗切成1.0 cm左右的莖段轉接入不同激素組合的增殖培養基中培養。通過觀察各處理培養35 d后的試管苗可知，因激素種類、濃度的不同，不定芽的生長狀況表現出明顯的不同。篤斯越橘莖段或莖尖的離體增殖率受到培養基中細胞分裂素的調控，伸長生長除受細胞分裂素調控外，還受生長素的調控。將試管苗各性狀測量結果進行極差分析。結果表明，無論苗高還是分化增殖苗數均是RZT>R6-BA，即玉米素對試管苗的縱向生長、苗的分化增殖都起著決定性調控作用。但對于苗高性狀而言，ZT的1水平作用效果明顯；對于分化增殖而言，ZT的2水平作用效果明顯。添加6-BA時，外植體也增殖，但增殖效果遠不如ZT。方差分析表明，無論對于控制篤斯越橘試管苗的苗高還是分化增殖數，6-BA、ZT兩因素不同水平間差異均極顯著(P<0.01)。按F值分析，F值大的因素對結果影響較大，結果也與上述分析一致。由表2可知，處理①培養的試管苗向高生長最快，其次是處理⑧，且與其他處理間差異顯著(P<0.05)；以處理⑧培養的試管苗分化增殖倍數最多，其次是處理⑤，且與其他處理間差異顯著(P<0.05)。綜上所述，在保證試管苗增殖率的前提下，應選擇苗木較高、生長旺盛的處理，即選擇培養基(處理⑧)WPM(改良)+6-BA1.0 mg/L+ZT1.0 mg/L為篤斯越橘的分化增殖培養基。

表2 不同處理篤斯越橘植株性狀比較

注：要求芽苗高度≥0.5 cm；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 篤斯越橘試管壯苗的培養將接種試管苗的培養瓶放置于不同光照條件下，培養50 d，結果見表3。由表3可知，經不同光照處理的試管苗生長狀況也不同。處理①培養的試管苗長勢相對較弱，呈纖細狀態，葉片小，葉色嫩綠，莖桿柔嫩、色淺。處理②培養的苗木莖桿相對粗壯，色紅，有一定的韌性，葉片完全展開，葉色濃綠、有光澤。雖然高度低于處理①，但其他性狀均優于處理①。因此，在試管苗移栽前進行壯苗培養非常必要，使試管苗莖桿增粗，葉片發紅，幼莖組織充實，提高木質化程度。經過鍛煉的試管苗，葉片抗蒸騰作用和適應能力增強，光合性能顯著提高，適應外界環境的能力增強，從而促進根系萌發，提高瓶外生根率。

表3 不同光照處理篤斯越橘試管苗生長狀況

2.6 篤斯越橘試管苗瓶外生根技術研究

2.6.1不同基質對篤斯越橘存活率的影響。將經過壯苗培養的試管苗成叢取出，剪去頂端部分保留苗高約2.0 cm，用清水洗凈基部培養基。試管苗基部速蘸0.5%KMnO4消毒，然后浸蘸生根激素ABT 30 s，栽到經KMO4消過毒的有機基質中誘導生根。

苗木移栽7 d左右不同基質上的試管苗出現不同程度的萎蔫，其中以摻有稻殼成分的基質較為嚴重。移栽后約12 d苗木從靠近基質的部位開始返青，移栽后約18 d存活的植株都已經返青，并出現不同程度的生長。莖桿增粗，植株挺立，葉片展開，濃綠。萎蔫的苗木則全株枯黃，埋入基質部分已經腐爛。其中以基質⑤、⑥效果最好，存活率分別為63.4%和56.8%(表4)。

表4 不同基質中篤斯越橘苗木存活情況 %

2.6.2不同激素濃度對篤斯越橘試管苗生根的影響。從篤斯越橘試管苗移栽的第2周開始，每周噴施一次與移栽時相同濃度的生根激素，保持空氣相對濕度在80%～90%。通過6組試驗得出，在同一移栽基質中蘸取生根激素ABT 1 000 mg/L的組培苗生根較早，且生根速度較快。生根最早的是經ABT 1 000 mg/L處理的⑤號基質，試管苗約在移栽第13天開始生根，第18天根長可達1.2 cm，且有分支；而蘸取生根激素ABT 500 mg/L的組培苗約在移栽的第21天開始生根，生根速度相對較慢。以基質⑤培養的試管苗生根速度較快，根系較多、有分支，且以ABT 1 000 mg/L處理的試管苗平均生根率最高，為72.4%(表5)。

2.6.3不同空氣濕度對篤斯越橘苗木存活率的影響。將苗木移栽到基質⑤中，20 d后統計苗木存活狀況。由表6可知，在一定空氣濕度范圍內，組培苗存活率與空氣相對濕度呈正相關，空氣濕度越高，組培苗的存活率越高，其中以處理③最高。可見，組培苗移栽后，在苗床上方搭建小拱棚并覆蓋一層透明塑料布有助于保持空氣濕度，從而提高組培苗的存活率。

2.6.4不同移栽時間對篤斯越橘試管苗存活率的影響。將未切除愈傷組織的組培苗進行室外移栽，結果表明，不同月份移栽的篤斯越橘試管苗存活率差異較大(表7)，5月份棚內溫度中午可達30 ℃，篤斯越橘組培苗成活率較低；7月份氣溫達到一年中最高值，篤斯越橘組培苗移栽成活率最低；9月份氣溫開始下降，白天氣溫在20～26 ℃，但夜間溫度為5～10 ℃，氣溫轉涼后比較適于篤斯越橘這種喜陰涼植物的生長，存活率也大幅提升。

表5 不同激素處理篤斯越橘試管苗生根情況

表6 空氣濕度對篤斯越橘組培苗移栽存活率的影響

表7 不同移栽時間篤斯越橘的存活率 %

3 討論

(1)針對篤斯越橘在試管中難以生根或根系發育不良，吸收功能極弱，移栽后不易成活的特點，該試驗把生根和馴化相結合，采用試管苗瓶外生根技術，有效地縮短了育苗周期，降低生產成本，節省空間，同時杜絕因煉苗移栽造成死亡的現象，提高了苗木存活率。

(2)試管苗一般在高濕、弱光、恒溫條件下進行異養培養，出瓶后極易失水死亡。因此瓶外生根采取覆膜或噴霧等方法保證空氣相對濕度(80%～90%)，溫度控制在25 ℃左右較為適宜，并及時增加光照，以保證苗基部的正常呼吸，并防止葉片失水萎蔫。瓶外生根后期加強通風逐漸降低濕度和溫度，以增強幼苗的自養能力，促進葉片保護功能快速完善，氣孔變小，增強抗性和適應外界環境條件的能力，生根率提高。溫度、光照、基質水分和空氣濕度的平衡是獲得較高生根率的保證[6]。

(3)該研究采用經發酵的混合有機基質誘導生根，結果表明，不同基質試管苗生根效果差異較大，其中以處理⑤較適宜誘導生根，且以ABT 1 000 mg/L生根效果較好。該基質比無機基質輕，營養豐富，便于攜帶，有效地降低勞動強度。同時利用該基質可以有效減少換苗床土造成的苗木死亡率。

4 小結

(1)篤斯越橘新品種“紫水晶”外植體采用0.1%升汞消毒3 min是較合適的滅菌方法，既達到滅菌的目的，又對外植體無損傷。

(2)以3月份接種的嫩芽相對染菌率低，生長速度較快，初分化早，在接種的第8天開始分化。7月接種染菌率高，10月接種芽苗生長緩慢。

(3)該研究表明，WPM(改良)+6-BA 1.0 mg/L+ZT 1.0 mg/L為篤斯越橘“紫水晶”的分化增殖培養基，培養35 d平均苗數7.1個，平均苗高5.83 cm。

(4)通過增加光照強度(3 000 lx)進行試管壯苗培養，使試管苗莖桿增粗，葉片發紅，幼莖組織充實，木質化程度提高，從而增強適應外界環境的能力。

(5)將經過壯苗培養的試管苗速蘸(30 s)ABT 1 000 mg/L于9月份進行試管外生根誘導，移栽基質為混配有機基質鋸末+樹皮+草炭=1∶1∶1，空氣相對濕度80%～90%，培養溫度為20～25 ℃，移栽50 d后生根率達72.4%。

[1] 王輝,王鵬云,王蜀,等.我國藍莓發展現狀及前景[J].農業現代化研究，2008,29(2):250-253.

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[6] 張彩玲,朱延明,曹天旭. 藍莓“美登”組培快繁及瓶外生根技術的研究[J].特產研究,2012(1):40-43.

Key Technology of CultureinvitroofVacciniumuliginosum“Zishuijing”

TIAN Xin-hua, WENG Hai-long, LI Jing, XING Ya-juan*

(Heilongjiang Institute of Forestry Sciences, Harbin, Heilongjiang 150081)

[Objective] To discuss cultureinvitrokey technology forVacciniumuliginosum“Zishuijing”. [Method] Through explants sterilization method, sampling time, proliferation, rooting, seedling screening and optimization of culture, asexual matching reproduction system suitable for “Zishuijing” was established. [Result] The experiment shows: the sterilization of explants disinfection using 0.1% HgCl23 min; WPM (improved) +6-BA1.0 mg/L+ZT1.0 mg/L “Zishuijing” differentiation medium; rootless plantlets transplanted to sawdust mixed organic matrix in September: bark peat 1∶1∶1, air relative humidity 80%-90%, culture temperature of 20-25 ℃, the rooting rate reached 72.4%. [Conclusion]invitroculture key technology forVacciniumuliginosum“Zishuijing” was established, which will provide technical support for large-scale seedling.

Vacciniumuliginosum; Zishuijing;invitro; Condition optimization

黑龍江省林業廳資助項目(201004068-6)；森工總局科技成果轉化項目(sgzjT2013005)。

田新華(1976- )，女，黑龍江肇東人，副研究員，碩士，從事森林培育、遺傳育種研究。*通訊作者,研究員,博士，從事森林培育方面研究。

2015-02-09

S 188

A

0517-6611(2015)09-030-03