HPLC法同時測定四神片中兩種木脂素類化合物的含量

康宏玲，王志強，劉曉輝

(1.沈陽工學院生命工程學院，遼寧撫順 113122；2.撫順市消防支隊清原縣消防大隊，遼寧撫順 113300；3.山東安池農牧科技有限公司，山東濟南 250220)

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HPLC法同時測定四神片中兩種木脂素類化合物的含量

康宏玲1，王志強2，劉曉輝3

(1.沈陽工學院生命工程學院，遼寧撫順 113122；2.撫順市消防支隊清原縣消防大隊，遼寧撫順 113300；3.山東安池農牧科技有限公司，山東濟南 250220)

[目的]建立了高效液相色譜法同時測定四神片中2種木脂素類化合物含量的分析方法。[方法]采用迪馬公司Diamonsil(鉆石)C18柱，以乙腈∶水=75∶25(v/v)為流動相，柱溫25 ℃，進樣量10 μl，流速0.8 ml/min，DAD程序檢測，檢測波長216 nm。[結果]2種木脂素類化合物五味子甲素和五味子乙素在各自的線性范圍內線性關系良好，相關系數分別為0.999 6、0.999 8，平均回收率分別為94.50%、96.61%，RSD分別為1.9%、2.0%。[結論]該方法簡單、靈敏、準確，實現了對四神片中2種木脂素類化合物的同時測定。

高效液相色譜法；四神片；木脂素；含量

四神片是現今臨床常用方劑，其味酸、辛，能助腎散寒，止瀉消脹，主要用于腎虛受寒、腸鳴肚脹、五更溏瀉、食物不化、久瀉不止、面黃體弱[1]，其主要成分為肉豆蔻(制)、吳茱萸、補骨脂、五味子、干姜、大棗(去核)。方藥五味子中的木脂素類化合物具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效[2]。筆者采用RP-HPLC法同時測定四神片中五味子甲素和五味子乙素2種木脂素類化合物的含量，以便對其片劑質量進行更好的監管，為四神片的質量標準提供更好的方法和依據。

1 材料與方法

1.1 儀器Agilent HP1100高效液相色譜儀(配有四元梯度泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器)；超純水發生系統(MILLIPORE公司)； CX-300W超聲波清洗機(北京市醫療設備二廠)； LG10-2.4A型高速離心機(北京醫用離心機廠)；ES-120型電子天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司)；一次性使用無菌注射器(上海凱樂輸液器廠)；Ф13 mm 0.22 μm一次性微孔樣品過濾膜(希波氏)等。

1.2 試藥四神片(沈陽雙鼎制藥有限公司)；乙腈，色譜純(Fisher Chemicals公司)；甲醇，色譜純(Fisher Chemicals公司)；五味子甲素和五味子乙素，均為化學對照品(中國藥品生物制品檢定所)；無水乙醇，分析純(安徽安特生物化學有限公司)；正己烷，分析純(國藥集團化學試劑有限公司)；水為超純水。

1.3 試驗方法

1.3.1對照品溶液的制備。準確稱取五味子甲素和五味子乙素標準品各0.010 0 g，加入乙腈溶解并定容于10 ml容量瓶中，混勻，配制成1 000 μg/ml混合對照品儲備液，備用[3]。

1.3.2供試品溶液的制備。取四神片10片，研細，精密稱取2.000 0 g，加入10 ml 80%乙醇溶液于比色管中，超聲提取3次，每次超聲時間為30 min，冷卻后用80%乙醇溶液定容于50 ml容量瓶中，混勻，離心分離取上層清液經0.22 μm微孔濾膜過濾后待測。

1.3.3色譜條件。色譜柱為Diamonsil(鉆石)C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬公司)，流動相為乙腈和水，流動相配比為乙腈∶水=75∶25 (v/v)，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μl，流速為0.8 ml/min；DAD檢測器，檢測波長為216 nm。

1.3.4方法學考察。

1.3.4.1系統適應性試驗。分別精密吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μl，按“1.3.3”的色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，考察系統適應性。

1.3.4.2標準曲線的繪制。分別精密吸取“1.3.1”項下的混合對照品儲備液0.01、0.04、0.10、0.50、1.00、2.00 ml于10 ml容量瓶中，用乙腈定容配置成一系列標準溶液，取各標準溶液進樣分析，以進樣濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.4.3精密度試驗。精密吸取10 μl混合對照品溶液(1.00 μg/ml)連續進樣10次，測定峰面積值，計算其RSD值。

1.3.4.4穩定性試驗。精密吸取供試品溶液10 μl在0、4、8、12、16、20、24 h分別進樣分析，測定峰面積并計算RSD值。

1.3.4.5重復性試驗。取同批供試品試樣10份，按“1.3.2”方法平行制備供試品溶液，進樣分析，測定峰面積的RSD值。

1.3.4.6回收率試驗。取同批供試品試樣6份(五味子甲素和五味子乙素的含量分別為164.8和210.3 μg/g)，每份精密稱取2.0 g左右并加入200 μg/ml混合對照品溶液2.00 ml，按“1.3.2”方法制備供試品溶液，進樣分析，測定五味子甲素和五味子乙素的平均含量、回收率及RSD值。

1.3.5樣品含量測定。在“1.3.3”的色譜條件下，取5批供試品樣品，按“1.3.2”方法制備供試品溶液進樣分析，分別計算五味子甲素和五味子乙素的含量。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1系統適應性試驗。從圖1a可以看出，五味子甲素和五味子乙素的保留時間分別是14.7和18.3 min，分離效果很好；在樣品圖(圖1b)中也在同一時間出現了相應的色譜峰，且樣品中其他干擾峰沒有影響分離效果，經計算分離度均大于1.5，滿足分析的要求。

2.1.2標準曲線的繪制。通過繪制標準曲線，得五味子甲素的回歸方程為Y=79.625X-2.021，相關系數為0.999 6；五味子乙素的回歸方程為Y=77.462X-5.205，相關系數為0.999 8。結果表明，五味子甲素和五味子乙素在相應的線性范圍內線性關系良好。

2.1.3精密度試驗。取1.00 μg/ml混合對照品溶液連續進樣10次，經計算五味子甲素和五味子乙素峰面積的RSD值分別為0.7%和0.8%，表明該試驗所用儀器的精密度良好。

2.1.4穩定性試驗。對供試品溶液在1 d內的進樣分析得出五味子甲素和五味子乙素峰面積的RSD值分別為1.2%和1.8%，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內穩定性良好。

2.1.5重復性試驗。取同批次供試品10份，進行平行測定，得出五味子甲素和五味子乙素峰面積的RSD值分別為2.4%和2.1%，表明該試驗重復性良好。

2.1.6回收率試驗。從表1可以看出，五味子甲素和五味子乙素2種化合物的平均回收率分別為94.50%和96.61%，RSD值分別為1.9%和2.0%，表明該方法回收率良好、準確度高。

表1 樣品中五味子甲素和五味子乙素的加標回收率

2.2 樣品含量測定在最佳的試驗條件下，5批樣品中五味子甲素的含量分別為164.8、164.9、164.2、165.3、162.6 μg/g，五味子乙素的含量分別為210.3、211.4、210.5、210.1、209.4 μg/g(n=3)。

3 結論與討論

3.1 討論

3.1.1分析方法的選擇。根據相關文獻的報道，木脂素類化合物的分析方法主要有分光光度法、薄層色譜掃描法、毛細管電色譜法、高效液相色譜法和液質聯用法等，近年來應用比較廣泛的是高效液相色譜法，從分析成本上看高效液相色譜儀比液質聯用儀更為便宜且分析效能高、選擇性好、分析速度快、靈敏度高，為此試驗選擇采用高效液相色譜法。

3.1.2色譜條件的考察。

3.1.2.1流動相及配比的選擇。該試驗曾以甲醇-水為流動相，結果2種化合物出峰時間大大延長，且色譜峰明顯變寬，從樣品的色譜分離圖也能看出，2種化合物與其他物質分離效果不好，有包峰現象，為此試驗選擇乙腈-水為流動相，乙腈溶劑強度大、粘度小，使五味子甲素和五味子乙素的洗脫和分離效果更好，為了使保留時間縮短，綜合考慮分離度和測定時間該試驗選擇乙腈∶水=75∶25的流動相配比。

3.1.2.2檢測波長的選擇。該試驗采用DAD檢測器，此檢測器可對被測物質的紫氣-可見吸收光譜圖進行快速的動態掃描，可以直接得到每種組分的最大吸收波長，而組分以最大吸收波長作為檢測波長能減小基線漂移，可以大大提高檢測的靈敏度，通過對組分進行紫外光譜掃描可知2種組分均在216 nm處有最大吸收峰，所以試驗選擇216 nm為最佳檢測波長。

3.1.3樣品前處理方法的選擇。通過正交試驗，試驗考察了不同的提取方法(冷浸提取法、超聲提取法、回流提取法)、提取試劑(正己烷、乙腈、乙醇、80%乙醇、60%乙醇)、提取次數(1、2、3次)和提取時間(20、30、40、60 min)的影響，結果表明采用80%的乙醇溶液超聲提取3次，每次提取時間30 min為最佳。

3.2 結論在上述確定的試驗條件下，2種木脂素類化合物能與樣品中其他物質達到良好的分離，通過DAD檢測器進行定性分析，2種物質的出峰先后順序為五味子甲素和五味子乙素，沒有包峰現象。試驗方法簡便、準確、靈敏、重現性好，可以滿足日常分析的要求，可作為四神片質量控制的常用方法。

[1] 慶俊，于金蘭，董國剛. RP-HPLC測定四神片中補骨脂素和異補骨脂素的含量[J]. 吉林醫藥醫學學報，2008，29(6)：354.

[2] 趙永德，崔惠玲，李娟. 五味子的藥理作用及臨床應用[J]. 中華臨床醫藥與護理·藥物與臨床，2005(6)：41-43.

[3] 裴毅，聶江力. 高效液相色譜法測定五味子乙素含量[J]. 植物研究，2005，25(3)：373-375.

康宏玲(1979-)，女，遼寧大連人，講師，碩士，從事儀器分析、藥物分析、食品分析和環境分析等研究。

2015-02-15

S 567

A

0517-6611(2015)09-070-02