酶聯(lián)免疫法測定水產(chǎn)品中氯霉素的殘留量

歐 翔

(貴陽市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，貴州貴陽 550081)

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酶聯(lián)免疫法測定水產(chǎn)品中氯霉素的殘留量

歐 翔

(貴陽市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，貴州貴陽 550081)

[目的] 探索水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的快速檢測方法。[方法]采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定魚、蝦類水產(chǎn)品中氯霉素的殘留量。[結(jié)果] 檢測的20個(gè)水產(chǎn)品中有1個(gè)陽性樣品，其他樣品均為陰性。ELISA方法的檢出限為0.01 μg/kg，平均回收率為76.1%～90.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) ≤3.21%，在0.025～1.600 ng/ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.997 5。[結(jié)論]該檢測方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均符合殘留分析質(zhì)量控制的要求，適用于大批量水產(chǎn)品中氯霉素殘留的快速檢測。

酶聯(lián)免疫法；水產(chǎn)品；氯霉素；殘留量

氯霉素(Chloramphenicol，簡稱CAP)是由委內(nèi)瑞拉鏈絲菌產(chǎn)生的抗生素，由于抗菌效果好，價(jià)格低廉，曾在一段時(shí)間內(nèi)廣泛用于防治和治療動物疾病，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)也有廣泛的使用范圍[1]。氯霉素存在嚴(yán)重的毒副作用，能夠抑制骨髓造血功能，引起人類的再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥以及新生兒、早產(chǎn)兒灰色綜合癥等疾病，低濃度的藥物殘留還會誘發(fā)致病菌的耐藥性，因此氯霉素殘留問題正引起國際組織和世界上許多國家和地區(qū)的高度重視，自2003年以來我國出口水產(chǎn)品頻頻被進(jìn)口國檢出氯霉素殘留，歐盟因氯霉素殘留問題將我國產(chǎn)凍蝦產(chǎn)品納入其食品快速預(yù)警機(jī)制[2]。水產(chǎn)品中氯霉素殘留成為嚴(yán)重的食品安全問題之一。動物源性食品中氯霉素的殘留受到世界各國和地區(qū)的高度重視，2002年我國農(nóng)業(yè)部公布了《動物性食品中獸藥最高殘留量》，規(guī)定氯霉素在動物性食品中不得檢出[3]。

對于氯霉素的殘留，由于存在多種檢測方法，高效的檢測方法在氯霉素殘留控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。筆者采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)對水產(chǎn)品中氯霉素殘留量進(jìn)行測定。ELISA方法檢測限為0.01 μg/kg，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均符合殘留分析質(zhì)量控制的要求，適用于大批量水產(chǎn)品中氯霉素殘留的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品。從貴陽市各養(yǎng)殖場隨機(jī)抽取有代表性的鯉魚、草魚、鯽魚、武昌魚、黃臘丁、鰱魚、鱸魚、桂魚、江團(tuán)、蝦共20個(gè)樣品。將魚去皮，去骨，取背部肌肉將其切成小塊，用均質(zhì)器均質(zhì)；蝦去皮開殼，取可食部分用均質(zhì)器均質(zhì)，均制成均質(zhì)物。

1.1.2試劑。乙酸乙酯(分析純)；正己烷(分析純)；去離子水；氯霉素試劑盒(靈敏度為0.025 ng/ml)：96孔酶標(biāo)板、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(0、0.025、0.100、1.400、1.600 ng/ml)、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品100 ng/ml、氯霉素酶標(biāo)物、氯霉素抗試劑、底物A和B溶液、終止液、濃縮洗液(10倍)、氯霉素濃縮樣品稀釋液(4倍)，購自力德力諾生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.1.3主要儀器。酶標(biāo)儀(Thermo 51118305)；渦旋儀；離心機(jī)；洗板機(jī)；電熱恒溫培養(yǎng)箱；天平：感量0.1 g；氮吹儀； 聚苯乙烯離心管50 ml；微量進(jìn)樣器：單道 10～100、100～1 000、8道30～300 μl。

1.2 方法

1.2.1樣品處理。稱取(3.00±0.05)g均質(zhì)物的樣品于50 ml離心管中，加入6 ml乙酸乙酯并振蕩混勻5 min；室溫4 000 r/min離心10 min；取4 ml上清液置入玻璃離心管中，于60 ℃下氮?dú)獯蹈桑幌虿Ａщx心管中加入1 ml正己烷，振蕩混勻；再加入1 ml樣品稀釋液強(qiáng)烈振蕩1 min；室溫4 000 r/min離心5 min，用吸管吸去上層正己烷，棄掉，取下層液體70 μl用于分析。

1.2.2樣品測定。從試劑盒中取出酶標(biāo)板，排序好后按順序分別往微孔中加入70 μl氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液和樣品加標(biāo)溶液，每個(gè)溶液做3個(gè)平行。然后，再用多道移液器加入氯霉素酶標(biāo)物50 μl/孔，和氯霉素抗試劑30 μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置于25 ℃避光環(huán)境中反應(yīng)30 min。小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗板機(jī)，充分洗滌5次，洗好后拍干。加入底物液A和底物液B液各50 μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置于25 ℃避光環(huán)境中反應(yīng)20 min，加入終止液50 μl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于雙波長450/630 nm檢測，測定每孔OD值。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及樣品濃度的計(jì)算。所獲得的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、樣品加標(biāo)OD值(B)除以第1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品(0標(biāo)準(zhǔn))的OD(B0)再乘以100即為標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、樣品加標(biāo)的吸光度比值(%)。以吸光度比值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)每個(gè)樣品的吸光度比值值從曲線上讀出相對應(yīng)的樣品濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)表1標(biāo)準(zhǔn)品檢測結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，氯霉素含量(x,ng/ml)與吸光度比值(y=B/B0,%)的線性方程為y=-18.627 ln(x)+12.806，相關(guān)系數(shù)R為0.997 5。從圖1可以看出，氯霉素在0.025～1.600 ng/ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果

2.2 樣品中氯霉素的殘留量由表2可知，黃臘丁樣品中氯霉素的殘留量為0.378 μg/kg，超過水產(chǎn)品中氯霉素限量標(biāo)準(zhǔn)(<0.3 μg/kg)，判為陽性(+)，其他樣品中氯霉素的殘留量均小于0.3 μg/kg，判為陰性(-)。

表2 樣品中氯霉素的殘留量

2.3 回收率與檢出限取已均質(zhì)的3.00 g樣品，分別加0.67、1.00和1.33 μg/kg 3個(gè)濃度3次重復(fù)的添加回收率試驗(yàn)。由表3可知，水產(chǎn)品中氯霉素的平均回收率為76.1%～90.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) ≤3.21%。這說明添加量越小，回收率越高。該試劑盒的靈密度為0.025 ng/ml，此方法檢出限=(靈密度×定容體積×提取體積/分取體積)/稱樣量=0.025×1×1.5/3=0.01 μg/kg。

表3 樣品中氯霉素的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 討論

(1)ELISA是酶聯(lián)記的抗原與抗體進(jìn)行的抗原-抗體反應(yīng)，由于酶的專一性催化作用, 酶聯(lián)板上多份樣品同時(shí)檢測, 該方法操作簡單, 靈敏度、精密度較高。該試驗(yàn)的檢出限為0.01 μg/kg, 回收率為76.1%～90.7%, 且在0.025～1.6 ng/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系, 相關(guān)系數(shù)為0.997 5。運(yùn)用該方法進(jìn)行水產(chǎn)品中氯霉素殘留篩選，能在短短幾小時(shí)內(nèi)檢測幾十份樣品，且不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，樣品預(yù)處理簡單，檢測成本低，檢測結(jié)果準(zhǔn)確率高。因此，ELISA 是測定大量水產(chǎn)品中氯霉素含量的一種好方法，在現(xiàn)場監(jiān)控和日常大批量檢測中有著十分廣闊的應(yīng)用前景。

(2)考慮酶聯(lián)免疫法檢測的影響因素較多,容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果, 最好采用該方法篩選, 陽性樣品再用GC-MS 聯(lián)用技術(shù)或HPLC 確證, 則可獲得更加準(zhǔn)確的檢出結(jié)果。影響試驗(yàn)結(jié)果的因素包括：①樣品中的脂肪會影響提取效果，對于高脂肪樣品，去除脂肪的步驟非常重要。②待測樣品不易反復(fù)凍融，隨著反復(fù)凍融，蛋白質(zhì)分子(抗原或抗體)易發(fā)生構(gòu)型改變或影響抗原-抗體的結(jié)合。③在進(jìn)行酶聯(lián)免疫程序以前，一定要將所有試劑回升至25 ℃左右。如果不在此溫度范圍內(nèi)操作，所測定的OD值會偏低。④每批次樣品均要進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。⑤加樣量、溫育時(shí)間、洗版程序均按要求操作，否則也會影響試驗(yàn)結(jié)果。

[1] 馬國軍，曲秋芝，吳文化，等.抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用[J].水產(chǎn)學(xué)雜志，2001，14(1):73-76.

[2] 劉麗麗.酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的影響因素及控制方法[J].齊魯漁業(yè)，2010,27(2)：7-9.

[3] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號：動物性食品中獸藥最高殘留限量[S/OL].(2002-12-24)http://jckspaqj.aqsiq.gov.cn/dwyxspjyjy/gnxgbz/200610/t20061027-9809.htm.

Determination on the Residual Amount of Chloramphenicol in Aquatic Products by Enzyme-linked Immnunoassay

OU Xiang

(Agricultural Products Analysis and Testing Centre of Guiyang City, Guiyang，Guizhou 550081)

[Objective] The research aimed to discuss a rapid method for determining the residual amount of chloramphenicol in aquatic products. [Method] The residual amounts of chloramphenicol in aquatic products (such as fish and shrimps) were determined by using ELISA. [Result] Among 20 tested aquatic products, the detection result of one sample was positive and those of the others were all negative. The detection limit of ELISA was 0.01 μg/kg, and the average recovery rate was 76.1%-90.7%, and the relative standard deviation (RSD) was less than or equal to 3.21%. There was a good linear relationship in the range of 0.025-1.600 ng/ml, with the correlation coefficient of 0.997 5. [Conclusion] The sensitivity, accuracy and precision of this ELISA all could meet the requirements of quality control of residual analysis, so this detection method was suitable for rapid detection of chloramphenicol residues in large scale of aquatic products.

ELISA; Aquatic products; Chloramphenicol; Residual amount

歐翔(1982- )，女，貴州遵義人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測。

2015-02-11

S9-9

A

0517-6611(2015)09-110-02