急性冷應激對中華鱉幼鱉Vc合成能力和組織Vc含量的影響

龔 勛， 牛翠娟， 錢美亞， 周勇相， 王 丹

(1.貴州理工學院輕工工程學院，貴州貴陽 550003； 2.北京師范大學生命科學學院，生物多樣性與生態工程教育部重點實驗室，北京 100875；3.貴州工程應用技術學院生態工程學院，貴州畢節 551700)

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急性冷應激對中華鱉幼鱉Vc合成能力和組織Vc含量的影響

龔 勛1,2,3， 牛翠娟2*， 錢美亞2， 周勇相3， 王 丹3

(1.貴州理工學院輕工工程學院，貴州貴陽 550003； 2.北京師范大學生命科學學院，生物多樣性與生態工程教育部重點實驗室，北京 100875；3.貴州工程應用技術學院生態工程學院，貴州畢節 551700)

以中華鱉幼鱉為研究對象，研究了急性冷應激對中華鱉幼鱉內源Vc合成能力和不同組織Vc含量的影響。在水溫(29±1) ℃條件下，用不添加Vc的基礎飼料對中華鱉幼鱉(體重(206.31±28.33)g)進行投喂，馴化3周后開始急性冷應激試驗，應激條件為(13±0.7) ℃，6 h。結果表明，幼鱉在急性冷應激6 h后GLO活力較冷應激前有所升高，但未達到顯著水平(P>0.05)。冷應激前后肝臟組織Vc含量與腦組織Vc含量均未發生顯著變化。此外，雌性幼鱉與雄性幼鱉的GLO活力存在較大差異，但由于樣本量偏少，尚不能斷定是否確實存在這種性別差異。急性冷應激對幼鱉的Vc合成能力具有一定的促進作用，對肝臟組織Vc含量與腦組織Vc含量沒有顯著影響。

急性冷應激；L-古洛糖酸內酯氧化酶；組織Vc含量；中華鱉

中華鱉(Pelodiscussinensis)是我國重要的經濟水產養殖動物，具有較高的食用價值和藥用價值。目前，已在中華鱉腎臟中檢測到L-古洛糖酸內酯氧化酶(L-gulonolactone oxidase，GLO)活性，表明中華鱉具有內源Vc合成能力[1]。研究表明，動物在脅迫環境下內源Vc不能滿足正常生命活動需要，日糧中添加Vc可以降低糖皮質激素(皮質醇或皮質酮)分泌，避免因其分泌濃度過高而產生的免疫抑制作用，從而提高抗應激能力[2]。Zhou等在觀測外源包膜Vc對中華鱉應激反應的影響時也發現，應激后對照組皮質醇水平顯著升高，而Vc添加組皮質醇水平沒有顯著變化[3]。飼料中添加500 mg/kg的Vc多聚磷酸酯，有助于鱘魚對LPS造成的應激反應[4]。大量研究表明，飼料Vc的添加對動物的免疫力和抗應激能力的提高具有一定的促進作用[2-6]。但如果飼料中不添加外源Vc，僅靠中華鱉自身生產的內源Vc是否也能滿足其在應激條件下的生理需求則有待研究。研究表明，應激會影響某些動物內源Vc 的合成能力與組織Vc分布。肉仔雞在熱應激狀態下血漿Vc含量降低，肝臟Vc合成能力下降，據此推測在應激狀態下動物體的GLO活力會受到抑制[7]。動物在遭受氧化脅迫和饑餓應激時GLO活力均會受到影響，饑餓應激會顯著抑制仔雞的GLO活力[8]。饑餓應激會顯著降低豚鼠脾臟、肝臟和腎上腺的Vc含量[9]。此外，饑餓應激對GLO活力的影響具有物種特異性。饑餓會降低大鼠的GLO活力，而對灰松鼠則無顯著影響[10]。目前，有關應激對中華鱉自身Vc合成能力和組織Vc含量的影響的研究甚少。筆者研究了沒有外源Vc補充的情況下中華鱉幼鱉在急性冷應激下其自身內源Vc合成能力與組織Vc含量的變化，評估了急性冷應激對幼鱉Vc需求的影響，從而為龜鱉Vc營養生理提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物試驗用鱉為2齡幼鱉(前1年孵化)，馴養在80 cm×35 cm×30 cm大小的玻璃缸中。每缸均為2只鱉，水深約15 cm，水溫為(29±1) ℃，養殖用水為曝過氣的自來水，pH 7.9，溶氧量大于5 mg/L。動物馴化期間投喂不含Vc的基礎料，馴化時間為3周。馴化結束，鱉的體重為(206.3±28.3) g。

1.2 試驗方法隨機挑選健康的中華鱉幼鱉，設8個平行，每個平行2只鱉。馴化結束后將鱉饑餓48 h，開始進行急性冷應激試驗。應激前取樣，各組每個平行取1只鱉。將缸中原有的水迅速泵掉，換上等量提前曝過氣的自來水，水溫為(13.0±0.7) ℃，冷應激時間為6 h。應激結束將剩余的幼鱉快速處死并取血，冰上立即解剖，取出肝臟、腎臟和腦組織，用凍存管分裝后放入液氮中，最后轉入-80 ℃下冷凍保存備測。

1.2.1組織中Vc含量的測定。采用高效液相色譜法(HPLC)進行檢測[3]。稱取一定量組織(肝臟或腦)，迅速將其剪碎，并置于小玻璃勻漿器內，加入2 ml 15%的偏磷酸迅速而充分地冰上研磨，4 ℃下20 000 g離心20 min后取上清，0.45 μm過濾器過濾，進行高效液相色譜分析，液相色譜分析條件如下：色譜柱：KONTRON C18(5 μm，4.6×250 mm)；流動相：甲醇∶磷酸溶液體積比為6∶94，pH 2.63；檢測波長為243 nm；流速為1 ml/min；進樣量為20 μl。采用外標法，峰高定量。標準曲線的制作方法同上，只是將待測樣換成不同濃度梯度的Vc標準品。該試驗中測定的是還原態和氧化態抗壞血酸的總和(Total ascorbic acid，TAA )。

1.2.2腎臟GLO活力的測定。腎臟GLO活性的測定方法是在Dabrowski等[11]、Maeland等[12]和Ching等[13]的基礎上進行了一些改進。樣品處理：稱取一定量幼鱉腎臟(0.125 g左右)，加入4倍體積冰冷50 mmol/L pH7.4的磷酸緩沖液(含1 mmol/L EDTA，0.2% 脫氧膽酸鈉 Sodium deoxycholate)，迅速置于冰上充分勻漿，4 ℃下15 000 g離心10 min收集上清，取A、B 2支小指管，各加入200 μl上清液、650 μl上述磷酸緩沖液以及50 μl 50 mmol/L谷胱甘肽(Glutathione，購自Sigma公司)溶液，A管作為反應管，再加入反應底物100 μl 100 mmol/L L-古洛糖酸內酯(L-gulonolactone，購自Sigma公司)；B管作為對照管，將底物替換成100 μl上述磷酸緩沖液。2管均在25 ℃孵育3 h，加入1 ml 30%偏磷酸終止反應，冰上放置5 min，20 000 g離心20 min后，取上清液，然后按照上述測定Vc的步驟分別測定A、B管中Vc的含量，以組織中的GLO將底物在單位時間內催化生成的Vc量為GLO活力單位(μg TAA/h.g組織)。

1.3 數據統計與分析試驗結果均以平均值±標準誤(Mean ± S.E.)表示，使用統計軟件包SPSS 15對試驗數據進行統計與分析。先對各組數據進行正態分布檢驗(One-sample Kolmogorov-Smirnov Test)和方差齊性檢驗(Test of homogeneity of variances)。在滿足這2個條件的前提下，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行分析。如果差異顯著，則用LSD(Least significant difference)進行兩兩比較。若不滿足這2個條件，則采用非參數檢驗。顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 急性冷應激對中華鱉幼鱉Vc合成能力的影響若不考慮性別因素，中華鱉幼鱉在6 h急性冷應激前后GLO活力變化如圖1所示。從圖1可以看出，幼鱉在急性冷應激后GLO活力有所升高，但未達到顯著水平(P=0.286)。

若考慮性別因素，中華鱉雌雄幼鱉在6 h急性冷應激前后GLO活力變化如表1所示。由表1可知，中華鱉幼鱉在急性冷應激前雄性GLO顯著高于雌性(P<0.05)。雌性在急性冷應激后GLO顯著的升高(P<0.05)。雄性在急性冷應激后GLO有所降低，但不顯著(P>0.05)。

表1 雌雄幼鱉在急性冷應激前后的GLO活力變化 μg TAA/h·g

2.2 急性冷應激對中華鱉幼鱉組織Vc含量的影響從圖2～3可以看出，中華鱉幼鱉肝臟組織Vc含量和腦組織Vc含量在6 h急性冷應激前后均無顯著變化。

3 討論

3.1 急性冷應激對中華鱉幼鱉Vc合成能力的影響在經歷6 h急性冷應激后，中華鱉幼鱉的GLO活力沒有出現下降，反而略有升高。這與以前的一些應激研究結果有所不同。熱應激狀態下肉仔雞GLO活力會受到抑制[7]。仔雞在長時間的饑餓脅迫下的GLO活力受到顯著抑制[8]，而饑餓對灰松鼠的GLO活力則無顯著影響[9]。這可能與研究物種不同、應激方式、強度、作用時間不同有關。一般而言，急性冷應激常呈現免疫抑制，而慢性冷應激常引起免疫增強，溫和冷應激常引起免疫增強，重度冷應激引起免疫下降[14]。錢美亞等研究發現冬眠影響中華鱉稚鱉的GLO活力，稚鱉在冬眠始末的GLO活力無顯著變化，但在冬眠4周時GLO活力出現顯著下降[1]。該研究中應激條件為6 h 13 ℃的低溫應激，這種短時間的急性冷應激不同于慢性應激，能在一定程度上刺激幼鱉體內Vc的合成，提高GLO活力。由于Vc可以通過間接的方式增強動物對環境的抗應激能力。為了緩解急性冷應激對生理活動帶來的影響，動物對Vc的需求有所增加，而該研究結果表明短時間的急性冷應激能在一定程度上促進體內Vc的合成。但是，Vc對于應激后免疫功能的保護作用應與應激的強度與類型以及應激持續的時間有關，在該試驗中可能由于應激不是特別強烈，持續時間也較短，因此幼鱉冷應激前后均未出現顯著差異。應激強度、持續時間與Vc需求之間的關系還需進一步研究。

有些物種的GLO活力還存在性別上的差異，雌性淡水魟的腎臟GLO活力顯著高于雄性[15]。30周齡的成雞中，母雞的腎臟Vc合成能力顯著高于公雞[16]。Jenness等對幾種哺乳動物的研究表明，在大鼠中雄性個體GLO活力高于雌性，而在狗與兔中情況正好相反[10]。Kuo等報道雌雄小鼠肝臟GLO活力與其mRNA表達量均無差異[17]。筆者發現非應激狀態下雄性中華鱉GLO活力顯著高于雌性，但由于樣本量偏少的緣故，尚不能準確斷定。有關中華鱉GLO活力是否具有性別差異，還有待進一步研究。

3.2 急性冷應激對中華鱉幼鱉組織Vc含量的影響大量研究表明，應激過程對于動物組織中Vc的含量有影響。經歷3 h淺水應激的菱羊鯛肝臟中Vc含量有顯著下降[18]。在饑餓脅迫下，豚鼠肝臟、脾臟和腎上腺的Vc含量均會顯著降低[19]。長時間的熱應激會引起肉仔雞的血漿Vc含量降低[7]。在該研究中，中華鱉幼鱉在6 h急性冷應激前后肝臟組織Vc含量和腦組織Vc含量均未發生顯著變化。這可能與應激類型、強度及持續時間長短有關，也可能是動物本身代謝機制的差異所造成的。該研究結果表明，在急性冷應激6 h后，幼鱉肝臟中Vc含量有所上升，但差異不顯著。這說明6 h的低溫應激對幼鱉肝臟組織Vc含量沒有顯著影響，由于時間較短幼鱉在應激過程中消耗的Vc較少，這部分消耗的Vc可以直接從血漿中獲取，對肝臟中Vc含量并無顯著影響。Zhou等研究表明24 h的酸應激對中華鱉肝臟Vc含量沒有明顯影響[3]，應激對肝臟組織Vc含量的影響可能與應激類型強度，應激持續時間及本身的Vc貯存能力有關。

研究表明，Vc在加速神經物質的轉運方面有重要作用[20]。腦是中樞神經系統主要的組成部位，幼鱉在受到急性冷應激時優先保護中樞神經系統。該研究表明，6 h急性冷應激前后幼鱉的腦組織Vc含量無顯著變化，說明短時間的低溫應激還沒有對幼鱉的腦組織Vc含量產生明顯的影響，推測幼鱉在受到急性冷應激后消耗的Vc優先從機體其他部位(血漿或肝臟中)獲取，因此腦中Vc含量在應激以后并沒有明顯變化。綜上所述，冷應激對于幼鱉組織中Vc的含量的影響與應激類型、應激強度、應激時間及能力有關。有關中華鱉幼鱉應激前后Vc在機體組織中分布的規律及轉運的調控機制，有待進一步研究。

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Effects of Acute Cold Stress on Biosynthesis of Vc and Tissue Vc Concentration in JuvenilePelodiscussinensis

GONG Xun1, 2, 3, NIU Cui-juan2*, QIAN Mei-ya2et al

(1. School of Light Engineering, Guizhou Institute of Technology, Guiyang, Guizhou 550003; 2. College of Life Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875; 3. School of Ecological Engineering, Guizhou University of Engineering Sciences, Bijie, Guizhou 551700)

The effect of acute cold stress on biosynthesis of Vc and tissue Vc concentration in juvenilePelodiscussinensiswas investigated. The juvenileP.sinensis(206.31 g ± 28.33 g) were fed with basal diet under 29 ℃±1 ℃. After 3 weeks, the acute cold stress was carried out. Stress condition: 13 ℃±0.7 ℃, 6 h. The results showed that GLO activity elevated to some extent, but not significantly(P>0.05). Liver and brain Vc concentration did not change obviously. In addition, there seemed a sexual difference of GLO activity in juvenileP.sinensis, which could not confirmed due to un-enough samples. The acute cold stress on biosynthesis of Vc has a role in promoting in juvenileP.sinensis, but there was no significant effect on the liver and brain tissue Vc concentration.

Acute cold stress; L-gulonolactone oxidase; Tissue Vc concentration;Pelodiscussinensis

貴州省科學技術

(黔科合J字[2013]2007)；貴州省大學生創新訓練項目(201310668002)。

龔勛(1983- )，女，湖南益陽人，副教授，博士，從事分子生理生態學研究。*通訊作者，教授，從事動物生理生態學研究。

2015-02-11

S 947.1

A

0517-6611(2015)09-118-03