土壤中固氮菌對農藥抗性的研究

喬秀麗，遲彩霞

(綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江綏化 152061)

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土壤中固氮菌對農藥抗性的研究

喬秀麗，遲彩霞

(綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江綏化 152061)

[目的]了解自生固氮菌對不同農藥的抗性。[方法]根據固氮菌自身的特點，應用無氮培養基分離自生固氮菌獲得純種的自生固氮菌；通過抑菌圈試驗及分光光度計測定其吸光值研究了草甘膦異丙胺鹽、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、咪錳·多菌靈3種常用農藥對自生固氮菌生長的影響。[結果]草甘膦異丙胺鹽對自生固氮菌生長有促進作用；甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽對自生固氮菌有較小的抑制作用，并且該農藥自身不穩定，易被分解；咪錳·多菌靈對固氮菌有強烈抑制作用。[結論]試驗結果為田間正確使用農藥提供了理論依據。

自生固氮菌；抑菌圈；農藥；抗性

自20世紀90年代以后，農業高產主要依靠大量使用農藥、化肥，致使我國成為世界污染大國。農藥的使用致使土壤中的固氮菌生長受到抑制，造成土壤肥力下降，使得人們不得不繼續增加化肥的使用量來提高農作物產量，惡性循環使綠色食品離人們越來越遠。應用現代科學技術，建立和完善生物固氮體系已經成為解決人類目前所面臨的人口、糧食、能源和環境等問題的重要措施[1-6]。

固氮菌在自然界分布十分廣泛，可以固定空氣中的游離氮轉變為生物可以利用的氮元素[7-10]。固氮反應是地球上維持生產的一個重要的生態反應。研究固氮菌對農藥是否有一定的抗藥性(耐藥性)及農藥對自生固氮菌是否有影響，已是迫在眉睫的問題[11-16]。為此，筆者將不同地點的土樣在無氮培養基上進行分離和純化，同時采用抑菌圈法和分光光度計測吸光值的方法，檢測了常用的不同種類田間農藥對自生固氮菌生長的影響及自生固氮菌對農藥的抗性，以期為田間正確使用農藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑與藥劑。95%乙醇、葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、氯化鈉、碳酸鈣、瓊脂粉、結晶紫、碘、碘化鉀、番紅均為分析純；草甘膦異丙胺鹽水劑(上海惠光環境科技有限公司)、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽乳油(湖北巨勝科技有限公司)、咪錳·多菌靈可濕性粉劑(吉林長春長雙農藥有限公司)。

1.1.2儀器。XSP-BM-8C型顯微鏡(上海上光儀器有限公司)、HPX-9162 MBE數顯電熱培養箱(上海波徐實業有限公司醫療設備廠)、SW-CJ-2F超雙人雙面凈化工作臺(江蘇蘇州凈化設備有限公司)、BL-50A立式壓力滅菌器(上海東亞壓力容器制造有限公司)、752型紫外-可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1培養基的配制與自生固氮菌的分離純化。

1.2.1.1培養基的配制。無氮固體培養基：葡萄糖15.0 g，硫酸鎂0.3 g，磷酸二氫鉀0.3 g，硫酸鈣0.3 g，氯化鈉0.2 g，碳酸鈣7.5 g，瓊脂粉3.0 g，無菌水150 ml，調節pH至6.5～7.0，滅菌備用[17-18]。使用時加入相應濃度的農藥。液體培養基：上述配方不加瓊脂粉。上述成分在0.1 MPa、121 ℃下滅菌20 min，冷卻后再加葡萄糖。

1.2.1.2土壤采集及處理。在樹林中鏟去表面2 cm表面土，取5～10 cm深層土壤，裝入滅過菌的燒杯中，密封保存，采取多點取樣，標記取樣地點、時間、環境。將土樣于4～5 ℃冰箱中保存。

試驗時將土樣混合均勻，放于28 ℃恒溫箱中烘干水分，然后放于紗布中進行過篩。去除土塊以及雜物，留下粉狀土樣。

1.2.1.3固氮菌的分離和純化。將滅過菌的無氮培養基融化，冷卻到50 ℃，倒入無菌培養皿中，凝固后制成平板。將準備好的土樣(與無菌水配制成泥漿狀)劃線接種到制備好的平板中，標明樣號、日期。置于28 ℃恒溫培養箱中培養、觀察。當接種部位長出透明、膠狀菌落時，進行純化，直至出現單菌落為止[19]。

1.2.1.4自生固氮菌革蘭氏染色鏡檢。取對數生長期的菌落進行革蘭氏染色[20]，油鏡觀察染色結果，并用已知菌作對照。

1.2.2農藥對自生固氮菌生長的影響。

1.2.2.1自生固氮菌最大吸收波長的測定。用接種環將純化的自生固氮菌接種于配制好的液體培養基中，28 ℃培養24 h。用紫外-可見分光光度計測其不同濃度的OD值，確定最大吸收波長為600 nm。

1.2.2.2抑菌圈試驗。取對數期液體菌種，在預先制作好的固體培養基上進行涂布接種。將直徑為1 cm的無菌濾紙浸泡于不同種類的農藥中，浸泡無菌水的濾紙片作為空白對照，烘干后放于涂布好的平板中，28 ℃培養48 h后觀察記錄抑菌圈大小。

1.2.2.3測定3種不同農藥對所分離固氮菌生長的影響。取處于對數生長期的液體自生固氮菌菌種1 ml，加入到液體無氮培養基中，分別加入1 ml農藥(農藥的濃度達到田間施用濃度)，以不加入農藥的液體無氮培養基作為空白對照，分別測0、4、6、8、24 h自生固氮菌的OD600 nm并做記錄。

2 結果與分析

2.1 菌落形態與革蘭氏染色觀察

2.1.1菌落形態觀察。單個菌落圓形或橢圓形，中間凸起，呈煎蛋狀、透明或半透明、乳白色或者乳黃色，表面光滑、濕潤、有光澤，有一定黏度，培養48 h后單個菌落直徑為1～2 mm，約為小米粒大小。

2.1.2革蘭氏染色觀察。試驗所獲得的自生固氮菌，革蘭氏染色為陰性，在顯微鏡下觀察為卵形、橄欖球狀或桿狀，單生或雙生(多呈“8”型雙生結構)，有時呈不規則堆狀(圖1)。

2.2 抑菌圈試驗結果由表1可知，草甘膦異丙胺鹽沒有抑菌圈，對自生固氮菌無抑制作用，與空白對照完全相同；而咪錳·多菌靈的抑菌圈直徑為13 mm，對固氮菌有較大抑制作用。甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的抑菌圈直徑為1 mm，只有在較高濃度時才對自生固氮菌有一定的抑制作用。

表1 各種農藥抑菌圈大小

2.3 3種不同農藥對所分離固氮菌生長的影響由圖2可知，在24 h內培養液中含咪錳·多菌靈的菌體吸光值逐漸下降，由0.061下降到-0.034，說明該藥對自生固氮菌有一定的抑制作用。培養液中含有草甘膦異丙胺鹽的菌體吸光值在4～6 h內下降，8～24 h內有所升高，但都高于對照組，說明該藥對所分離自生固氮菌沒有抑制作用，反而有一定的促進作用。這是因為該藥為氨基酸類農藥，自身吸光值較高；再者它本身可以作為自生固氮菌營養成分的一種，自生固氮菌可以從培養基中直接攝取。培養液中含有甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的菌株吸光值與對照相比略有降低，總體處于上升趨勢。原因是甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽自身不穩定，自生固氮菌將其分解后，對自生固氮菌無抑制作用；再有甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽是一種高效、廣譜的殺蟲劑，并不是專一殺菌劑，自生固氮菌易對該類藥物產生抗藥性。

3 結論

通過抑菌圈試驗及分光光度計測定其吸光值檢測草甘膦異丙胺鹽、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、咪錳·多菌靈3種常用農藥對自生固氮菌生長的影響。結果表明，自生固氮菌對不同農藥有一定抗性。具體為：草甘膦異丙胺鹽對自生固氮菌無抑制作用，反而有一定的促進作用；甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽對自生固氮菌有一定的抑制作用，但是抑制作用較小，并且自身不穩定，可以被自生固氮菌分解，所以自生固氮菌對甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽有一定的抗藥性；咪錳·多菌靈對自生固氮菌有強烈的抑制作用，自生固氮菌對該類農藥無抗藥性。

試驗僅限于自生固氮菌對農藥抗性的研究，其他固氮菌未涉及到，今后將對其他固氮菌進行深入研究，以完善相關資料，為我國農業的發展提供一定的理論依據。

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Research on Pesticide Resistance ofAzotobacterin the Soil

QIAO Xiu-li, CHI Cai-xia

(Food and Pharmaceutical Engineering College, Suihua University, Suihua，Heilongjiang 152061)

[Objective] The aim was to understand pesticide resistance ofAzotobacterin the soil. [Method] The pure abiogenousAzotobacterwas isolated through using nitrogen-free medium according to the characteristics ofAzotobacter. The effect of three commonly used pesticides such as Glyphosate isopropylamine salt, Emamectin benzoate and Carbendazim on abiogenousAzotobactergrowth were tested through the inhibition zone andODmeasured by spectrophotometer. [Result] The Glyphosate isopropylamine salt had a promoting effect on abiogenousAzotobactergrowth; Emamectin benzoate had little inhibitory effect, and the pesticide itself was not stable, easy to be broken down; Carbendazim had strong inhibitory effects onAzotobactergrowth. [Conclusion] The results provide theoretical basis for the correct use of pesticides in field.

AbiogenousAzotobacter; Inhibition zone; Pesticide; Resistance

黑龍江省科技特派員農村科技創業項目(111)；綏化學院新農村建設研究項目(SXK120101)。

喬秀麗(1963- )，女，黑龍江綏化人，教授，從事農副產品利用及檢測研究。

2015-02-11

S 474+.3

A

0517-6611(2015)09-129-02