低溫硝基苯降解菌的降解動力學研究

孫大鵬

(遼寧省環境監控中心，遼寧沈陽 110161)

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低溫硝基苯降解菌的降解動力學研究

孫大鵬

(遼寧省環境監控中心，遼寧沈陽 110161)

[目的]研究一株低溫硝基苯降解菌的降解動力學。[方法]對一株耐低溫硝基苯降解菌進行研究，考察了其最適生長條件及在不同硝基苯初始濃度下的生長和降解情況，并進行降解動力學研究。[結果]當溫度為15 ℃，pH為7，搖床轉速為140 r/min，接種量為10%時，最適宜該菌株生長。該菌株培養48 h對200 mg/L硝基苯的好氧降解率達60.53%。當硝基苯初始濃度>100 mg/L時，該菌株的降解動力學符合Andrews抑制方程-非競爭性底物抑制模型。[結論]該研究可為硝基苯實際廢水生化處理提供理論依據。

硝基苯；鮑曼不動桿菌；生物降解；動力學

硝基苯是一種帶有苦杏仁味的、淡黃色油狀液體，且不僅微溶于水，還易溶于乙醇、乙醚等有機溶劑。硝基苯是一種重要的化工合成原料，大量用于合成苯胺、炸藥、染料、塑料等，且在某些工業領域中，如醫藥和農藥等都具有重要的用途。尤為重要的是，硝基苯可以廢氣廢水為載體，或者以儲存運輸、生產過程中的意外事故為途徑大量進入環境。硝基苯進入水體會長時間保持不變[1-2]，對水體的污染持續時間相當長，并且硝基苯是高毒物質，具有“三致”效應，嚴重危害人體健康[3-4]，已被列入世界《環境優先控制有毒有機污染物》的名單前列[5-6]。

由于生物方法日趨成熟且成本較低，近年來較多使用[7-9]。該試驗將低溫保存的一株硝基苯降解菌進行馴化培養[10]，并對其影響硝基苯降解率的環境因素及不同初始濃度下的硝基苯降解進行研究，分析了降解動力學特征[11-12]，為硝基苯實際廢水生化處理提供理論數據。

1 材料與方法

1.1 菌種來源以東北制藥總廠曝氣池和集水池污泥為菌源，分離、篩選得到了一株在低溫條件下能以硝基苯為唯一碳源生長的菌株，經鑒定為鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)[10，13-14]。

1.2 培養基與試劑平板培養基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂20 g、蒸餾水1 L、pH 7.0。無機鹽培養基：Na2HPO4·12H2O 3.8 g/L、KH2PO41 g/L、NaCl 1 g/L、NH4Cl 0.1 g/L、MgSO40.2 g/L、蒸餾水1 L、pH 7.0。培養基中均添加一定量的硝基苯，121 ℃滅菌30 min。

1.3 試驗儀器恒溫振蕩培養箱(HZQ-QX，哈爾濱東聯電子技術有限公司)；滅菌箱(MLS-3750，日本三洋電機公司)；生化培養箱(LRH-250A，廣東省醫療器械研究所)；電子天平(BS110S，德國賽多利斯)；紫外分光光度計(Cary 50，美國Varian)；離心機(ANKE TGL-16G，上海安亭科學儀器廠)；冰箱(BCD-247，德國西門子)。

1.4 試驗方法

1.4.1菌株的馴化。 將低溫保存的鮑曼不動桿菌轉移到平板培養基上15 ℃進行培養，硝基苯濃度為30 mg/L，首次培養可能需要較長時間，大概3～4 d可以看到明顯菌落。然后將此菌落在同濃度硝基苯的條件下再次轉移，培養48 h后接種到50 mg/L硝基苯的平板上，之后逐漸增大硝基苯濃度。 無菌條件下將最后一次平板培養基的菌種置于硝基苯為50 mg/L的無機鹽培養基中，在培養箱中恒溫振蕩培養，每48 h進行轉移，并逐步提高硝基苯濃度。

1.4.2菌株最適生長條件的確定。

1.4.2.1最適溫度。配制無機鹽培養基100 ml于250 ml的錐形瓶中，硝基苯的濃度為200 mg/L(接入菌液后的體積和濃度)，以10%(體積分數)接菌量接入對數生長期菌液，分別在10、15、20、25、30、35 ℃恒溫搖床振蕩培養，pH為7，搖床轉速140 r/min，48 h后取樣測定菌株的生長和硝基苯降解情況。

1.4.2.2最適pH。在250 ml錐形瓶中配制體積為100 ml的無機鹽培養基，硝基苯濃度為200 mg/L(接入菌液后的體積和濃度)，以10%(體積分數)接菌量接入對數生長期菌液，15 ℃，搖床轉速140 r/min，pH分別為4、5、6、7、8、9恒溫振蕩培養，48 h后取樣測定菌株的生長和硝基苯降解情況。

1.4.2.3最適搖床轉速。配制無機鹽培養基100 ml于250 ml的錐形瓶中，硝基苯的濃度為200 mg/L(接入菌液后的體積和濃度)，以10%(體積分數)接菌量接入對數生長期菌液，15 ℃，pH為7，并以50、100、140、160和200 r/min的搖床轉速為條件進行振蕩培養，48 h后取樣測定菌株的生長和硝基苯降解情況。

1.4.2.4最佳接菌量。配制無機鹽培養基100 ml于250 ml的錐形瓶中，硝基苯的濃度為200 mg/L(接入菌液后的體積和濃度)，分別按1%、5%、10%、15%、20%(體積分數)的接種量接入對數生長期菌液，15 ℃，pH為7，搖床轉速140 r/min恒溫振蕩培養，48 h后取樣測定菌株的生長和硝基苯降解情況。

1.4.3硝基苯濃度對菌株的生長及降解的影響。分別配制100 ml無機鹽培養基于250 ml已滅菌的錐形瓶中，使硝基苯濃度分別為50、100、150、200和400 mg/L，加入體積分數為10%的對數生長期菌液，在pH為7，溫度為15 ℃，搖床轉速是140 r/min的恒溫培養箱中進行振蕩降解，每12 h進行取樣，繪制生長曲線并測定硝基苯濃度。

1.4.4降解動力學初步分析。將不同濃度的硝基苯加入以硝基苯為唯一碳源的無機鹽培養基中，于最佳降解條件下每隔一定時間取樣，測定在降解過程中硝基苯的濃度變化。根據試驗數據，進而求出相應硝基苯比降解速率，同時對所求的數據及初始濃度進行擬合，最終求出模型參數。

1.5 分析方法細胞濃度以新鮮去離子水作參比，采用光電比濁法測定溶液OD600。硝基苯濃度則采用氣相色譜法測定。對樣品進行離心后，取其上清液并用正己烷對上清液進行萃取，過無水硫酸鈉柱后進樣。氣相色譜條件：檢測器類型為EDC檢測器；進樣口溫度為210 ℃；柱溫為100 ℃，其保持1 min，然后以12 ℃/min升溫至210 ℃；檢測器溫度為300 ℃；進樣量為1 μl。

2 結果與分析

2.1 菌株生長的最適條件

2.1.1溫度對菌株生長的影響。由圖1可見，菌株在10～35 ℃條件下均可生長且對硝基苯有不同程度的降解。在15 ℃時，菌體的生物量以及對硝基苯的降解率均達到最大，為最適溫度，溫度過高會破壞細胞機體，甚至導致細胞死亡，影響菌體對硝基苯的降解。因此，15～25 ℃為最適菌株生長的溫度范圍。

2.1.2pH對菌株生長的影響。由圖2可知，菌株在中性到偏弱堿性條件下對硝基苯的降解能力較強。當pH在6～9之間時，菌株能夠保持其較好的生長能力以及硝基苯降解能力，特別是在pH為7時達到最大值，為菌株最適pH。由此可知，該菌株屬于中性微生物。

2.1.3搖床轉速對菌株生長的影響。對于好氧菌，轉速較高的情況下可以提高氧的轉移速率，從而使得菌株的生長得到促進，硝基苯的降解率得以提高，而在較低轉速的情況下，培養液中的溶氧量較少導致菌株生長量的下降。如圖3所示，當轉速<140 r/min時，菌株的生長及其降解能力都受抑制，而隨著轉速的增加，菌株的生長和降解能力有所提升。轉速>140 r/min時，菌株硝基苯降解速度和生長量增幅比較小，說明140 r/min已可以滿足菌株生長和降解的要求。因此，最適的搖床轉速為140 r/min。

2.1.4接種量對菌株生長的影響。由圖4可知，菌株的生物量隨著接種量的增加而逐漸增大，菌株對硝基苯的降解能力也漸漸得到提高，但是當菌株接種量>10%的時候，菌株的生長情況和降解能力并沒有隨著接種量的增加而顯著增長。這是因為接種量過大使菌株處于貧營養狀態，生長代謝能力受到抑制，從而降低硝基苯的降解速率。因此，最適接種量為10%。

2.2 不同硝基苯初始濃度下菌株的生長及硝基苯降解情況

2.2.1不同硝基苯初始濃度下菌株的生長情況。圖5為在以硝基苯為唯一碳源的無機鹽培養基中，硝基苯的初始濃度分別為50、100、150、200、400 mg/L，在上述最適生長條件下菌株的生長情況。由于硝基苯的毒性較大，對菌體的生長有很大的抑制作用，即便是經過馴化的降解菌也需要一定的適應期，因此前12 h為菌株的生長停滯期。12～48 h為菌株的對數生長期，菌株代謝機能活躍，個數呈對數增長，此時大量硝基苯被降解。48～72 h為菌株生長的穩定期，此期間菌株的生長和死亡達到動態平衡，個數基本維持不變。進入衰亡期是在72 h后，硝基苯的不足導致大多數的細胞出現了自溶現象并死亡， 菌株個數開始減少。如圖5所示，當硝基苯濃度為400 mg/L時，對菌體產生了非常明顯的毒性，菌體活性基本被抑制，菌株不生長。因此，該試驗菌體對硝基苯的耐受濃度為400 mg/L。

2.2.2不同初始濃度下菌株降解硝基苯的情況。從圖6所展現的菌株對硝基苯的降解情況可知，當搖床轉速為140 r/min，溫度為15 ℃，pH為7時，當50 mg/L作為硝基苯初始濃度時，硝基苯可于72 h時被完全降解；初始濃度為100和200 mg/L時，菌株經48 h降解率分別達到了77.13%和60.53%。對數生長期是降解的主要發生期，主要是由于這個期間菌株具有較強的繁殖能力，隨之增大的還有其對碳源的需求，降解過程迅速，這就導致了硝基苯濃度下降較快。而在此之后，培養基中的硝基苯已經減少又沒有新的碳源來進行補充，代謝產物也接連不斷地積累，菌體的數量基本上呈現不增加的狀態，降解緩慢。

2.3 硝基苯的生物降解動力學如圖7所示，當硝基苯初始濃度低于100 mg/L時，菌株對硝基苯的降解符合零級反應動力學，即c=-kt+b(c為硝基苯的濃度，k為降解速率，t為降解時間，b為常數)。反應速率與硝基苯濃度呈正比例關系，降解率隨著硝基苯濃度的增加而增加，說明在100 mg/L范圍內硝基苯的濃度越高，微生物利用營養物質也越充分，因此能夠更好地進行生長和大量繁殖，從而提高了降解速率。

由于硝基苯對微生物具有毒性，當硝基苯的初始濃度增加至一定程度時，反應速率不再隨著初始濃度的增加而升高，降解率下降，因為高濃度條件下對微生物產生了抑制現象。當硝基苯初始濃度>100 mg/L時，采用簡單且常用的Andrews抑制方程-非競爭性底物抑制模型(式1)對菌株降解硝基苯進行動力學描述。

(1)

式中，μmax為硝基苯的最大比降解速率(h-1)，S為硝基苯濃度(mg/L)，KS和Ki分別為底物飽和常數和底物抑制常數(mg/L)。根據所取得的試驗結果，通過非線性最小二乘法對數據進行擬合，得出的動力學模型參數分別為μmax= 2.059 h-1，KS=54.682 mg/L，Ki=64.138 mg/L。對式(1)求導，得出S=(KSKi)1/2=59.22 mg/L，μ取最大值為0.72 h-1, 這一結果為硝基苯廢水的生物處理工藝提供了重要的參考條件。

3 結論

(1)將在低溫條件保存下的一株能以硝基苯為唯一碳源生長的鮑曼不動桿菌進行復壯，其最適生長條件為溫度15 ℃，pH為7，搖床轉速140 r/min，接種量10%。

(2)在以硝基苯為唯一碳源的無機鹽培養基中，鮑曼不動桿菌12 h進入對數生長期，48 h趨于穩定生長，72 h后開始衰亡。當硝基苯初始濃度為50 mg/L，72 h可被完全降解，菌株48 h對濃度為200 mg/L硝基苯的降解率是60.53%，無法直接降解400 mg/L的硝基苯。

(3)當硝基苯初始濃度低于100 mg/L時，菌株對硝基苯的降解符合零級反應動力學，相關系數為0.981～0.995。硝基苯初始濃度>100 mg/L時，采用Andrews抑制方程-非競爭性底物抑制模型進行擬合，模型參數分別為μmax= 2.059 h-1，KS=54.682 mg/L，Ki=64.138 mg/L。

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Study on Degradation Kinetics of Low-temperature Nitrobenzene Degrading Bacteria

SUN Da-peng

(Liaoning Province Environmental Monitoring Center, Shenyang, Liaoning 110161)

[Objective] The research aimed to study degradation kinetics of low-temperature nitrobenzene degrading bacteria. [Method] The optimal growth condition of low-temperature nitrobenzene degrading bacteria, and its growth and degradation situations under different initial concentrations of nitrobenzene were inspected, and its degradation kinetics was studied. [Result] Under the condition of temperature 15 ℃, pH 7, rotation speed 140 r/min and inoculum amount 10%, it was optimal for the bacteria growth. After cultivated for 48 h, degradation rate of 200 mg/L nitrobenzene by the bacteria reached 60.53%. When initial nitrobenzene concentration was more than 100 mg/L, degradation kinetics of the bacteria corresponded to Andrews inhibition equation-non-competitive substrate inhibition model. [Conclusion] The research could provide theoretical basis for biological treatment of actual nitrobenzene wastewater.

Nitrobenzene;Acinetobacterbaumannii; Biological degradation; Kinetics

孫大鵬(1977-)，男，遼寧沈陽人，碩士，從事環境污染源監控管理研究。

2015-02-09

S 181.3;X 172

A

0517-6611(2015)09-243-03