解毒活血滋陰方免疫抑制作用有效部位的篩選研究

卞 華， 郝鵬飛， 呂 芹， 山書玲， 付衛云， 張瓅方

（1.南陽理工學院醫學院，河南南陽473004；2.南陽醫學高等專科學校，河南南陽473061）

解毒活血滋陰方免疫抑制作用有效部位的篩選研究

卞 華1， 郝鵬飛1， 呂 芹2， 山書玲， 付衛云1， 張瓅方1

（1.南陽理工學院醫學院，河南南陽473004；2.南陽醫學高等專科學校，河南南陽473061）

目的分離并篩選解毒活血滋陰方對系統性紅斑狼瘡免疫抑制作用的有效部位。方法制備解毒活血滋陰方水溶性部位、乙醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、乙醇部位的提取物。在體內研究中，采用小鼠遲發型超敏反應模型和雞紅細胞誘導的小鼠血清溶血素生成模型，觀察解毒活血滋陰方不同提取部位對細胞免疫和體液免疫的影響；體外研究檢測解毒活血滋陰方不同提取部位對ConA及LPS誘導的小鼠T、B淋巴細胞增殖的影響。結果解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位能夠明顯減輕小鼠遲發型超敏反應小鼠耳腫脹、降低小鼠的脾指數和胸腺指數，對雞紅細胞誘導的小鼠血清溶血素生成具有抑制作用。同時解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位各劑量組均可抑制T、B淋巴細胞增殖，且呈一定劑量依賴性。結論解毒活血滋陰方治療系統性紅斑狼瘡免疫抑制作用的有效部位可能是水溶性部位和乙酸乙酯部位。

解毒活血滋陰方；系統性紅斑狼瘡；有效部位；免疫抑制作用

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種原因未明，以多系統或器官病變和血清中出現多種自身抗體為特征的自身免疫性疾病。解毒活血滋陰方由白花蛇舌草、生地、赤芍、青蒿、山茱萸等中藥組成，具有解毒活血、滋陰清熱之功效，其治療系統性紅斑狼瘡療效顯著，且具有較高的安全性［1-3］。但該方治療系統性紅斑狼瘡的主要藥效部位尚不清楚，傳統的水煎煮法導致一些水不溶性成分難免會流失。本研究以藥效評價為導向，通過體內、體外實驗探討解毒活血滋陰方不同提取部位對細胞免疫、體液免疫功能和脾淋巴細胞增殖的影響，篩選其免疫抑制作用的有效部位，闡明其藥效物質基礎。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級ICR小鼠，雌雄各半，18～22 g，6～8周齡，購自于中國科學院上海實驗動物中心，許可證號為SCXK（滬）2012-0002。

1.2 藥物與試劑 解毒活血滋陰方所含藥物 （白花蛇舌草、生地、赤芍、青蒿、山茱萸等）由南陽理工學院附屬醫院提供，經黃顯章副教授鑒定均符合 《中國藥典》2010年版標準；醋酸地塞米松片（Dexamethasone，Dex），天津天藥藥業股份有限公司生產，批號110420；二硝基氟苯 （2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）、刀豆球蛋白A（ConA）、脂多糖 （LPS）、四甲基偶氮唑藍 （MTT）均購于美國Sigma公司；胎牛血清（FCS）購于杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI-1640、十二烷基磺酸鈉（SDS）購于美國Gibco公司。

1.3 主要儀器 Biocell 2010酶聯免疫檢測儀（奧地利Anthos公司）；Ti-S型研究級倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Thermo 8000型CO2培養箱（美國Thermo Fisher公司）；超凈工作臺（河南智誠科技發展有限公司）；Sartorius電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；冷凍干燥機 （美國Labconco公司）。

2 方法

2.1 解毒活血滋陰方不同部位的制備 將全方藥材按照一定比例組合后混勻，以75%乙醇浸漬48 h，每12 h更換一次溶劑，過濾合并濾液備用；藥渣分別以8倍、6倍量水煎煮兩次合并濃縮后得水溶性部位；對藥渣再次分別以乙醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇進行提取，得到乙醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；取乙醇浸出液，濃縮后凍干得干燥粉末，加入水混懸后分別以乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，依次分別得到乙醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液，分別與上述相應提取液合并；而最終所剩即為乙醇部位。

2.2 遲發型超敏（DTH）反應測定實驗 取80只ICR小鼠，按體質量分層隨機分出10只作為空白對照組，其余小鼠參照相關實驗方法［4］建立DTH小鼠模型：實驗開始第1天和第2天在小鼠腹部固定部位脫毛，面積約3 cm2，于去毛部位涂0.5%DNFB（以丙酮-橄欖油4∶1的比例配置）40μL致敏，第7天于左耳內外側涂0.3%DNFB20μL激發。按體質量隨機將造模小鼠分為7組：模型組、Dex組（1.5 mg/kg）、水溶性部位組（966 mg/kg）、乙醚部位組（59 mg/kg）、乙酸乙酯部位組（188 mg/kg）、正丁醇部位組（22 mg/kg）、乙醇部位組 （321 mg/kg）。自致敏前2 d開始，按上述劑量每日灌胃實驗藥物0.2 mL/10 g，空白對照組、模型對照組灌胃等量蒸餾水，1次/d，連續8 d。激發48 h后頸椎脫臼法處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器在相同部位取直徑8 mm耳片，以游標卡尺測量厚度并以分析天平稱定質量，同時取小鼠胸腺及脾臟稱定質量。以左右耳片厚度、質量之差為腫脹度；以每10 g小鼠的脾質量和胸腺質量作為脾指數和胸腺指數脾。脾 （胸腺）指數=［脾 （胸腺）質量（mg）/體質量（g）］×10。

2.3 血清溶血素測定［5］取70只ICR小鼠，按體質量隨機分成7組：模型組、Dex組 （1.5 mg/kg）、水溶性部位組（966 mg/kg）、乙醚部位組（59 mg/kg）、乙酸乙酯部位組（188 mg/kg）、正丁醇部位組 （22 mg/kg）、乙醇部位組 （321 mg/kg）。按上述劑量每日灌胃實驗藥物0.2 ML/ 10 g，模型組灌胃等量蒸餾水，1次/d，連續給藥9 d。各組小鼠在給藥的第3天腹腔注射5%的雞紅細胞生理鹽水混懸液0.2 mL進行免疫。于免疫后第7天，末次給藥2 h后，小鼠眼球后靜脈采血制備血清，用生理鹽水1∶100稀釋后，取1 mL稀釋的血清與5%的雞紅細胞混懸液0.5mL、10%補體（豚鼠血清）0.5 mL混勻，在37℃恒溫箱中溫育30 min，在冰水中中止反應，2 000 r/min離心10 min，取上清液加入 96孔培養板中，每孔200μL，于540 nm處比色，另設不加血清的對照管，以空白管調 “0”點，測各管的吸光度，以間接判斷血清中溶血素含有量。

2.4 脾細胞懸液的制備 將處死的小鼠放入75%乙醇中浸泡消毒1 min，無菌條件下取脾臟并去掉被膜，于200目篩網上輕捻脾組織，使細胞經篩網過濾至離心管中，離心 （1 500 r/min，10 min）后棄上清。用紅細胞裂解液除去紅細胞，用PBS沖洗2～4次。最后加入10%FCS-RPMI-1640培養液調節小鼠脾淋巴細胞為3×106個/ML備用。

2.5 T、B淋巴細胞增殖活性分析［6］分別檢測ConA刺激的T淋巴細胞增殖和LPS刺激的B淋巴細胞增殖。將上述脾細胞懸液接種于96孔培養板，每孔100μL。實驗分組如下：空白本底組 （只加RPMI-1640培養基），對照組 （加入終質量濃度為5μg/mL的ConA或10μg/mL的LPS）、不同質量濃度解毒活血滋陰方各部位提取物干預下的實驗組（分別加入終質量濃度為5、15、25、35μg/mL的各部位提取物）、Dex組 （加入Dex，終濃度同上），每組設10個復孔。將培養板于37℃，5% CO2溫箱中培養48 h。之后每孔分別加入10μL MTT溶液再繼續培養4 h，然后加入100μL/孔酸化的SDS，震蕩3 min，溫箱培養3 h。室溫20℃用酶標儀于波長490 nm處測吸光度 （A值），計算T、B淋巴細胞的抑制率。抑制率=［（對照組A均值-實驗組A均值）/（對照組A均值-空白本底組A均值）］ ×100%。

2.6 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差 （x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 解毒活血滋陰方不同提取部位的得率 由公式計算解毒活血滋陰方各提取部位的得率：得率%=（干燥粉末質量/全方藥材質量）×100%。結果顯示：水溶性部位為6.23%，乙醚部位為0.38%，乙酸乙酯部位為1.21%，正丁醇部位為0.14%，乙醇部位為2.07%。

3.2 解毒活血滋陰方不同提取部位對DTH小鼠耳殼腫脹度的影響 與空白組比較，DTH模型組耳殼增重和耳殼增厚顯著增加 （P＜0.01）。與模型組比較，解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位組均能明顯抑制小鼠耳殼的腫脹 （P＜0.01）。見表1。

表1 解毒活血滋陰方不同提取部位對DTH小鼠耳殼腫脹度的影響 （x±s，n=10）Tab.1 Effects of different extract fractions of JDHXZYF on auricle swelling in DTH Mice（x±s，n=10）

3.3 解毒活血滋陰方不同提取部位對DTH小鼠脾和胸腺指數的影響 與空白對照組比較，DTH模型組脾和胸腺指數均明顯升高 （P＜0.01）。與模型組比較，解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位組均可明顯降低小鼠免疫器官的臟器指數（P＜0.05，P＜0.01），同時解毒活血滋陰方乙醇部位組亦能降低小鼠脾腺指數 （P＜0.05）。見表2。

表2 解毒活血滋陰方不同提取部位對DTH小鼠脾和胸腺指數的影響 （x±s，n=10）Tab.2 Effects of different extract fractions of JDHXZYF on thymus index and sp leen index in DTH Mice（x ±s，n=10）

3.4 解毒活血滋陰方不同提取部位對雞紅細胞誘導的小鼠血清溶血素水平的影響 解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位組對雞紅細胞誘導的小鼠血清溶血素生成具有抑制作用，可減少小鼠血清中抗體的水平，與模型組比較差異具有顯著性（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

表3 解毒活血滋陰方不同提取部位對雞紅細胞誘導的小鼠血清溶血素的影響 （x±s，n=10）Tab.3 Effects of different extract fractions of JDHXZYF on the level of hemolysin induced by fow l erythrocyte immunization in serum（x±s，n=10）

3.5 解毒活血滋陰方不同提取部位對小鼠T、B淋巴細胞增殖的影響 如圖1、圖2所示，解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位各劑量組對ConA誘導的T淋巴細胞增殖和LPS誘導的B淋巴細胞增殖呈現明顯的抑制作用，與同組低質量濃度5μg/mL比較，15～35μg/mL抑制率差異有顯著性（P＜0.05，P＜0.01），其中質量濃度達到15 μg/mL時，乙酸乙酯部位組對T淋巴細胞增殖的抑制效應、水溶性部位組對B淋巴細胞增殖的抑制效應甚至高于Dex陽性對照組 （P＜0.05）。同時，質量濃度為25～35μg/ML乙醇部位組抑制率明顯高于低質量濃度5μg/mL（P＜0.05）。

圖1 解毒活血滋陰方不同提取部位對ConA誘導的T淋巴細胞增殖的影響 （x±s，n=10）Fig.1 Effects of d ifferent extract fractions of JDHXZYF on ConA-induced T lyMphocyte proliferation（x±s，n=10）

圖2 解毒活血滋陰方不同提取部位對LPS誘導的B淋巴細胞增殖的影響 （x±s，n=10）Fig.2 Effects of d ifferent extract fractions of JDHXZYF on LPS-induced B lymphocyte proliferation（x±s，n=10）

4 討論

系統性紅斑狼瘡 （SLE）的發生與遺傳、環境、感染、性激素等有關，其大部分臨床表現都是由致病性抗體、免疫復合物和T細胞所致，免疫系統功能失調是SLE的主要發病機制［7-8］。目前臨床上常用的免疫抑制劑如環磷酰胺、硫唑嘌呤、糖皮質激素等在治療SLE中發揮著重要作用，但這些藥物存在選擇性不強、毒副作用大等缺點［9］。因此，研究開發治療SLE的新型免疫抑制劑是目前亟待解決的問題。中藥解毒活血滋陰方是治療SLE的有效方劑，且具有較高的安全性。本研究將解毒活血滋陰方全方藥材分別采用有機性和水性溶劑進行提取，并建立不同部位研究體系，以藥效學方法篩選其治療SLE的免疫抑制活性部位，為后續解毒活血滋陰方針對免疫活性調節的藥效理論、藥效機制研究及開發新藥奠定基礎。

DTH是由效應T細胞介導，以單個核細胞浸潤和組織細胞損傷為主要特征的炎癥反應，與效應T細胞及其產生的細胞因子或細胞毒性介質有關，其反應強弱與機體T細胞免疫功能相一致。DNFB所致小鼠DTH是典型的Ⅳ型超敏反應實驗模型，作為DTH模型被廣泛用于藥物評價研究［10］。本研究結果表明，解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位明顯減輕DTH模型小鼠耳腫脹度，提示解毒活血滋陰方能抑制效應T細胞而減輕炎癥反應。免疫器官 （胸腺、脾）不僅是淋巴細胞分化成熟的場所，也是產生特異性免疫應答的場所，其質量升高或降低往往意味著機體淋巴細胞增殖的強弱，直接體現了免疫應答功能。本研究表明，解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位明顯降低DTH模型小鼠胸腺指數和脾指數，從而證實了解毒活血滋陰方能夠抑制小鼠體內淋巴細胞增殖。在體外解毒活血滋陰方不同提取部位干預T淋巴細胞增殖的實驗結果顯示，不同劑量解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位對ConA誘導的T淋巴細胞增殖呈現明顯的抑制作用，且乙酸乙酯部位高劑量（達到15μg/mL以上）抑制效應甚至優于Dex，呈一定劑量依賴性。上述結果提示解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位可干預淋巴細胞有絲分裂，抑制小鼠T淋巴細胞增殖，進而下調機體細胞免疫應答發揮免疫抑制作用。

B淋巴細胞受抗原——雞紅細胞刺激后，分化為漿細胞，漿細胞產生一種抗體——溶血素，當再次接受相同抗原刺激時，溶血素和抗原在補體的參與下發生免疫反應，產生溶血現象，而紅細胞溶血與血清溶血素含量有關。因此，測定其上清液的吸光度，則可間接判斷血清中溶血素水平，從而反映雞紅細胞免疫后小鼠的特異性體液免疫。本實驗結果表明，解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位對雞紅細胞誘導的小鼠血清溶血素生成具有抑制作用，提示能夠抑制小鼠的體液免疫應答。體外實驗也證明不同劑量的解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位能夠明顯抑制B淋巴細胞增殖，且水溶性部位高劑量 （達到15μg/mL以上）的抑制效應優于Dex。這一結果與體內實驗相一致，說明解毒活血滋陰方水溶性部位、乙酸乙酯部位具有抑制體液免疫的功能。

解毒活血滋陰方由白花蛇舌草、蘇木、青蒿、山茱萸等藥物組成，該復方所含成分包括：黃酮類、苯丙素類、萜類、揮發油、鞣質以及多種植物多糖、氨基酸等。現代藥理研究表明，白花蛇舌草能夠調節Th1/Th2細胞平衡，具有抑制免疫作用［11］；蘇木乙酸乙酯提取物能夠抑制淋巴細胞增殖，同時水提物能通過上調CD4+CD25+T細胞及Foxp3活性起到較強的免疫抑制作用［12-13］；青蒿素在體外明顯抑制刀豆蛋白A誘導的T淋巴細胞增殖，在體內能夠減輕變應性接觸性皮炎小鼠耳腫脹，降低小鼠的脾指數和胸腺指數，抑制NF-κB信號通路的活化，調節Th1/Th2免疫平衡，抑制炎癥反應和免疫功能［9，14］；山茱萸總苷通過抑制大鼠細胞免疫功能，抑制弗氏完全佐劑所致免疫性炎癥模型-大鼠佐劑性關節炎［15］。這些研究與本實驗結果是相符的。

綜上所述，解毒活血滋陰方水溶性部位和乙酸乙酯部位能明顯抑制小鼠DTH反應；抑制對雞紅細胞誘導的小鼠血清溶血素生成；抑制T、B淋巴細胞增殖，具有較好的免疫抑制活性，是其治療SLE的有效部位，但其調節免疫的作用機制還有待進一步研究。

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Screen of imMunosuppressive fractions froMJiedu Huoxue Ziyin Formula

BIAN Hua1， HAO Peng-fei1， LüQin2， SHAN Shu-ling1， FUWei-yun1， ZHANG Li-fang1

（1.Medical School of Nanyang Instituteof Technology，Nanyang 473004，China；2.Nanyang Medical College，Nanyang 473061，China）

AIMTo separate and screen immunosuppressive active fractions froMJiedu Huoxue Ziyin Formula（JDHXZYF）for systemic lupus erythematosus.METHODSDifferent extracts of JDHXZYF were prepared with water-soluble，ether-soluble，ethyl acetate，n-butanol，and ethanolic fractions.The in vivo cell and humoral immunity responses of JDHXZYF componentswere observed by delayed-type hypersensitivity（DTH）in mice and the production of specific hemolysin antibody against fowl erythrocyte.The effects of different extract fractions on ConA-induced or LPS-induced T lymphocyte and B lymphocyte proliferation were determined in in vitro tests.RESULTSThe water-soluble and the ethyl acetate fraction could alleviate auricle swelling in DTH mice and decrease the thymus and spleen index，and the seruMhemolysin level induced by fowl erythrocyte.Meanwhile，the watersoluble and the ethyl acetate fractions of JDHXZYF had obvious effects on the proliferation of T lymphocyte and B lymphocyte in a concentration-dependentmanner in vivo.CONCLUSIONThe water-soluble fraction and the ethyl acetate fraction can be identified as immunosuppressive active fractions of JDHXZYF for systemic lupus erythematosus.

Jiedu Huoxue Ziyin Formula（JDHXZYF）；systemic lupus erythematosus；active fraction；immunosuppressive action

R285.5

：A

：1001-1528（2015）05-0943-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.004

2014-09-01

河南省重點科技攻關計劃項目 （102102310167）

卞 華 （1973—），男，副教授，博士，從事自身免疫性疾病的研究。Tel：（0377）62071311，E-mail：biancrown@163.com