奧沙利鉑對原發性肝癌細胞系HUH-7的抗腫瘤效果評價

樸蓮淑 王迎春

大連大學附屬中山醫院消化內科，遼寧大連 116001

奧沙利鉑對原發性肝癌細胞系HUH-7的抗腫瘤效果評價

樸蓮淑 王迎春

大連大學附屬中山醫院消化內科，遼寧大連 116001

目的探討奧沙利鉑對原發性肝癌細胞系HUH-7是否會產生作用和影響，根據其對抗腫瘤的效果決定是否能夠應用于對肝癌細胞的臨床治療。方法把中科院2012年3月—2014年4月的肝癌細胞作為該試驗的研究對象，用流式細胞儀器對癌細胞的分布周期和死亡狀況進行分析，運用MTT法測試不同濃度和不同的作用時間的奧沙利鉑對肝癌細胞增長繁殖的抑制效果。通過多次試驗，得出最終結論。結果經過48 h作用后，癌細胞死亡率達到了11.8%，可見奧沙利鉑對于肝癌細胞的繁衍增長有著很強的抑制功效，并且呈現出計量和時間的依賴性。結論奧沙利鉑對原生性肝癌細胞系HUH-7的抗瘤效果明顯，它可以抑制肝癌細胞繁殖，使細胞周期停留在S期和G2PM期之間，進而使癌細胞死亡。但是其具體的運行機制還有待研究，因而奧沙利鉑能否應用于臨床治療還不能蓋棺定論。

奧沙利鉑；原發性；肝癌細胞；效果

原發性肝癌對人身體危害極大，且不易治愈。傳統的治療方法以手術為主，化療為輔。但是，這一治療方式有很大不足之處。有很多肝癌患者發現自己的病情、進行治療時肝癌已經發展到晚期，不能進行手術，因為此時的病人的體制已經太差，經不起手術的折騰。而且，近幾年肝癌患者在經過手術治療后，肝癌細胞發生轉移的幾率也越來越大。癌細胞的抗藥性很強，不利于患者的術后化療康復。因此，必須要找到一種能防止腫瘤轉移增殖的中藥來輔助治療。這樣一來，肝癌的中西醫聯合治療法就成為一種十分有益的輔佐方法。

大量的臨床資料顯示，奧沙利鉑對于多種類型腫瘤的治療都有很好的效果。它可以有效抑制癌細胞再生，且很安全無不良反。但是卻很少有人研究奧沙利鉑在人體內對肝癌細胞的影響。在該研究里，把中科院2012年3月—2014年4月的肝癌細胞作為該試驗的研究對象，就對這一問題進行研究，為它的臨床應用提供可靠的理論依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 細胞株QGY 由中科院細胞生物研究所提供的細胞株。這些細胞株是在含有15%胎牛血清RPMI1640營養液中,置于37℃、5%CO2環境下而培養出的。

1.1.2 試劑 分子量是396.97的奧沙利鉑，在使用時，可以用濃度為5%的葡萄糖注射液稀釋其濃度至所需濃度。胎牛血清。MTT，即甲基偶氮唑鹽。發生突變的Bax、Fas、P53等。

1.1.3 主要儀器 型號為HITACH-I600透視型電子顯微鏡 （日本）、型號為BIO-RAD2550的全自動酶標讀數儀器（美國）、倒置顯微鏡（日本）、流式細胞儀（美國）。

1.2 方法

1.2.1 檢測奧沙利鉑對細胞株的影響的方法 使用甲基偶氮唑鹽比色的方法進行實驗。用1.1%的胰蛋白酶將所選取的QGY細胞株進行消化，再放入胎牛血清濃度為15%的培養液中，將細胞株制成50 000/mL濃度的細胞液。并以200l1每孔的分量在96個培養板中進行接種。培養條件為37℃、5%CO2，培養時間分別是1 d、2 d。達到培養時間后，再取出原液，加入一定比例的培養液繼續進行培養。

1.2.2 檢測奧沙利鉑對癌細胞周期的作用的方法 用流式細胞儀器進行分析。把濃度為71%的乙醇加入到取得的細胞中用PI進行染色30 min。并用流式細胞儀器分析細胞周期的變化和肝癌細胞的死亡狀況。

1.2.3 檢測奧沙利鉑對基因蛋白的影響的方法 用免疫組織化學方法，對細胞株進行特殊培養，觀察其染色情況，按公式計算出相應的HSCORE得分。

1.3 統計方法

2 結果

2.1 奧沙利鉑對細胞的作用

奧沙利鉑能夠有效抑制肝癌細胞的增長，而且對劑量有很強的依賴作用，藥物的濃度越高，抑制作用越強；對時間也有依賴作用，抑制作用隨著藥物作用時間的增長而增長。即奧沙利鉑的濃度不同或者時間作用不同對肝癌細胞產生的影響程度也不同。見表1。

表1 比色（MTT）法檢驗出的奧沙利鉑對癌細胞的影響（）

表1 比色（MTT）法檢驗出的奧沙利鉑對癌細胞的影響（）

奧沙利鉑濃度24 h 48 h FP 16LmolPL 32LmolPL 64LmolPL 128 LmolPL 0.189 8±0.056 0.213 5±0.038 2 0.275 2±0.075 0.0173±0.817 7 0.390 2±0.013 5 0.607 1±0.061 9 0.743 2±0.016 4 0.817 6±0.041 4 348.178＜0.02

2.2 奧沙利鉑對細胞株周期和死亡情況的影響

奧沙利鉑對肝癌細胞作用時間達到24 h后，癌細胞周期基本都停在了S周期；在作用時間達到48 h后，細胞周期就被迫停在了S期和G2PM期之間，但仍主要在停在S期。而且奧沙利鉑作用于肝癌細胞24 h、48 h后，肝癌細胞死亡率分別是6.27%、11.8%，由此可見，隨著奧沙利鉑作用時間的增長，肝癌細胞的死亡率也在增長。

2.3 奧沙利鉑對相關基因蛋白的影響

使用奧沙利鉑后，Cyclin A定位在胞核中;MTP53陽性表達見于胞核 ;Bc-l 2、Bax及Fas定位在胞漿中;Myc的陽性表達于胞漿和胞核可見。奧沙利鉑作用于癌細胞72 h后,免疫細胞化學表Cyclin A、Bax表達增強(P＜0.03),MTP53、Bc-l 2及Myc表達減弱(P＜0.02),Fas表達差異無統計學意義(P＞0.06)。見表2。

表2 奧沙利鉑對QGY細胞周期蛋白及凋亡相關基因蛋白表達的影響（）

表2 奧沙利鉑對QGY細胞周期蛋白及凋亡相關基因蛋白表達的影響（）

醫抗體標本抑制奧沙利鉑表達方法 P細胞周期蛋白Cyclin A MTP53 Bc-l Bax Myc Fas 20 2.820±0.020 2.935±0.019 0.019＜0.01 20 20 20 20 20 2.771±0.009 2.787±0.005 2.367±0.102 2.675±0.007 2.686±0.011 2.502±0.007 2.669±0.005 2.726±0.005 2.520±0.008 2.675±0.029 0.007 0.005 0.005 0.008 0.029＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＞0.05

3 討論

在該研究中，采取了兩種方法對奧沙利鉑對癌細胞的作用進行了研究，有兩個重大發現：一是藥物作用于癌細胞48 h后，將癌細胞阻斷在S期和G2PM期之間，使癌細胞死亡率達到了11.8%；二是奧沙利鉑濃度為16 mol/L作用24 h影響為（0.189 8± 0.056），濃度為升為128 mol/L作用48 h影響升為了（0.817 6± 0.041 4）。實驗表明：奧沙利鉑對癌細胞有影響，能夠將肝癌細胞全部停留在S期和G2PM期之間，并逐步產生作用，誘導肝癌細胞走向凋亡。且奧沙利鉑對肝癌細胞起的作用大小呈現出對劑量、時間的依賴性。

大量歷史資料[2-3]表明：很多抗癌的藥品不會直接消滅肝癌細胞而是通過誘導機制使其逐步走向死亡，因為抗癌藥物在消滅癌細胞的同時可能會對正常的細胞產生不良作用。因而，研究新型的能誘導癌細胞自動凋亡的抗癌藥物是現代抗癌治療的新渠道。而奧沙利鉑是第3代鉑化合物，它能夠中斷DNA的合成，從而使癌細胞失去存活、增殖的基礎，有效抑制癌細胞增長，誘導其凋亡。

實驗證明，奧沙利鉑可以應用于肝癌的臨床治療，而且能夠取得很好的效果，是未來抗癌的一種重要的藥物。進一步對其進行開發研究，進行更多的實驗驗證，使其得到廣泛的臨床應用是醫學界的重要課題。

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Oxaliplatin for hepatocellular carcinoma cell line HUH-7 anti-tumor effect of the evaluation

PU lianShu WANG Yingchun
Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian Medical University,Dalian,Liaoning Province,116001 China

ObjectiveTo observe the effect of oxaliplatin on hepatocellular carcinoma cell line HUH-7 will produce the effect and influence,according to the anti-tumor effect decided whether to apply in the clinical treatment ofhepatocellular carcinoma cells.MethodsHepatoma cells as the object of study in this experiment,the distribution of cancer cell cycle were analyzed by flow cytometry instrument and death situation,using MTT method to test the inhibitory effect of different concentrations and different action time of oxaliplatin on hepatocellular carcinoma cell growth and reproduction of.Through many experiments,and draw the final conclusion.ResultsAfter 48 hours after the action of cancer cell death rate reached 11.8%,visible Asha Leigh Per has a very strong inhibitory effect on liver cancer cells multiplygrowth,and presents the measurement and time dependence.ConclusionAnti tumoreffect conclusion oxaliplatin on primary hepatocellular carcinoma cell line HUH-7 is obvious,it can inhibit the hepatoma cell reproduction,so that the cell cyclehere between the S phase and G2PM phase,and then make the death of cancer cells.But the specific operation mechanism remains to be studied,which could be used in the clinical treatment of oxaliplatin is not conclusive.

Asha Leigh Per;Primary;Hepatocellular carcinoma cell;Effect

R735

A

1674-0742（2015）02（c）－0089-03

2014-11-18）

樸蓮淑(1979.6-)，女，朝鮮族，吉林舒蘭人，博士，主治醫師，研究方向：肝硬化基因研究與干細胞治療，原發性肝癌基因研究與腫瘤肝細胞研究。