HPLC測定柿葉提取物中蘆丁在大鼠體內的血藥濃度及藥動學研究

陳楊芳

HPLC測定柿葉提取物中蘆丁在大鼠體內的血藥濃度及藥動學研究

陳楊芳

目的建立高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定柿葉提取物中蘆丁在大鼠體內的血藥濃度，并探討其在大鼠體內藥物代謝動力學（以下簡稱藥動學）特征。方法SD大鼠給予柿葉提取物灌胃，在不同時間點眼后靜脈叢取血，預處理后測定血漿中蘆丁的濃度，經3P97軟件處理數據。結果柿葉提取物中蘆丁在大鼠體內的藥動學符合二房室模型，蘆丁在體內較快地被吸收，給藥后1 h即達到峰濃度，峰濃度Cmax為（1.658±0.184） mg/L，其他主要藥動學參數吸收速率常數Ka=（2.436±0.883）/h、分布速率常數α=（1.002±0.372）/h、消除速率常數β=（0.083±0.067）/h、消除半衰期t1/2β=（9.418±7.256）h、藥-時曲線下面積AUC0-12=（9.628±2.281）mg·h/L。結論高效液相色譜法測定血漿中蘆丁濃度準確、簡便，適用于柿葉提取物中蘆丁的藥動學研究。

蘆丁；柿葉提取物；藥動學；高效液相色譜法

柿葉為柿樹科（Ebenaceae）柿樹屬Diospyros L.植物柿Diospyros kaki Thunb.的樹葉[1]，具有清熱解毒、潤肺強心、鎮咳止血、抗癌防癌等作用[2,3]。柿葉作為藥用始載于明朝《滇南本草》，曰“經霜葉敷臁瘡”；《本草再新》記載用于“治咳嗽吐血，止渴生津”；以后諸家本草及醫（藥）書也多有收載。黃酮類化合物是柿葉中主要的化學成分，已發現的黃酮類化合物有黃芪苷、槲皮素、異槲皮素、蘆丁、山萘酚3-O-β-D-葡萄糖苷、山萘酚、楊梅樹皮苷等[4]。蘆丁是其主要黃酮成分之一，有關蘆丁單體及柿葉總黃酮中蘆丁的藥動學研究已有相關報道[5,6]，但均為靜脈給予動物柿葉總黃酮后蘆丁在其體內的藥動學過程。本實驗通過研究大鼠給予柿葉提取物蘆丁灌胃后體內的藥動學，旨在揭示其在動物體內的動態變化特征，為開發心血管類藥品及保健食品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 日本島津LC-10AT高效液相色譜儀（包括SPD-10A紫外檢測器，N2000色譜工作站）；高速離心機（美國Sigma公司）；快速混勻器（江蘇金壇醫療儀器廠）；梅特勒AL204分析天平（梅特勒儀器有限公司）；微量移液器（大龍儀器公司）。

蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201409）；柿葉提取物（自制，HPLC法測得蘆丁含量為9.317 mg/g）；甲醇、乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團），其余試劑均為分析純。

雄性SD大鼠[江蘇大學動物實驗中心，合格證號：SCXK（蘇）2009-0002]5只，體重（250±20）g。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18（250×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.2%醋酸溶液=45∶55；流速：1 ml/min；紫外檢測波長：360 nm；柱溫30 ℃；進樣20 μl。

1.2.2 柿葉提取物的制備 稱取干燥的柿葉粉末適量，置燒瓶中，分別加入10、8倍量60%乙醇加熱回流提取2次，每次1 h，過濾，濾渣用60%乙醇潤洗，合并濾液，濃縮除乙醇并冷凍干燥即得，經HPLC測得提取物中蘆丁含量為9.317 mg/g。

1.2.3 對照品溶液的配制 精密稱取蘆丁對照品適量置10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制得含蘆丁81.6 mg/L的對照品溶液。

1.2.4 血漿樣品預處理 大鼠眼眶后靜脈叢取血0.3 ml置于已肝素化的離心管中，高速離心（13 000 r/min）5 min，分離得血漿。精密吸取血漿0.1 ml，加0.2 ml甲醇沉淀蛋白，渦流振蕩1 min，高速離心（13 000 r/min）5 min，取上清0.45 μm微孔濾膜濾過即得。

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 方法的專屬性 將空白血漿、空白血漿中加入蘆丁對照品、灌胃柿葉提取物血漿樣品按1.2.1色譜條件下進樣，考察蘆丁主峰的特異性，是否與其他峰分離度良好。

1.2.5.2 線性范圍及檢測限 精密吸取蘆丁對照品溶液適量，置于1 ml離心管中，加入大鼠空白血漿100 μl，配制成蘆丁濃度為0.204、0.408、0.816、2.040、4.080、8.160 mg/L的血漿樣本，并進行色譜分析，以峰面積Y對血藥濃度X進行線性回歸。

1.2.5.3 準確度和精密度 配制含蘆丁0.204、0.816、4.080 mg/L的低、中、高濃度的血漿樣品，各濃度測5次，連續測定3 d，計算蘆丁的含量，計算方法的準確度和精密度。

1.2.5.4 提取回收率 配制含蘆丁0.204、0.816、4.080 mg/L的低、中、高濃度的血漿樣品各5份，進樣20 μl，測定得到峰面積（5次測定的平均值）A1；以同時配制等濃度的對照品溶液進樣得到的峰面積（5次測定的平均值）A2作為對照，計算得低、中、高3個質量濃度的血漿樣品中蘆丁的提取回收率（R=A1 /A2×100%）。

1.2.5.5 穩定性考察 配制含蘆丁的低、中、高3個濃度0.204、0.816、4.080 mg/L的血漿樣品，考察室溫放置穩定性、臨時儲存穩定性及長期儲存穩定性。

1.2.6 藥動學研究 大鼠給藥前禁食不禁水，給予柿葉提取物4 g/kg（給藥劑量按蘆丁算為37.268 mg/kg）灌胃，以0.5%的羧甲基纖維素鈉制成混懸液灌胃，并于給藥前和給藥后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h眼眶后靜脈叢取血，置于肝素化離心管中，分離血漿，-20 ℃保存。再按“1.2.4血漿樣品預處理”項步驟操作。

1.3 統計學處理 數據均表示為，血漿中蘆丁的峰濃度Cmax及達峰時間Tmax由實測數據直接得出，其他藥動學參數由血藥濃度數據采用3P97軟件處理。

2 結 果

2.1 方法的專屬性 空白血漿、空白血漿中加入蘆丁對照品、灌胃柿葉提取物血漿樣品色譜圖見圖1，蘆丁與其他干擾組分分離效果良好，無雜質峰干擾。

2.2 線性范圍及檢測限 線性方程為Y=7729.5X+803.75（R2=0.9996），血漿中蘆丁在0.204～8.160 mg/L線性關系良好，血漿中檢測限為0.0408 mg/L。

2.3 準確度和精密度 該檢測方法的準確度及精密度結果見表1。

2.4 提取回收率 低、中、高3個濃度的血漿樣品中蘆丁的提取回收率分別為82.5%、80.7%、83.3%，平均提取回收率為82.2%，符合藥動學實驗要求。

2.5 穩定性考察 血漿樣品預處理后室溫下放置24 h穩定；樣品經4 ℃冰箱儲存3 d保持穩定；樣品在-20℃冰凍保存3周穩定。

2.6 藥動學結果 血藥濃度數據見表2，用3P97藥動學程序對血藥濃度數據擬合計算，結果表明柿葉提取物中的蘆丁在大鼠體內的藥動學符合二房室模型，主要的藥動學參數見表3，其平均藥-時曲線見圖2。

表1 血漿樣品中蘆丁的準確度和精密度 （n=5； ）

表1 血漿樣品中蘆丁的準確度和精密度 （n=5； ）

濃度（mg/L） 日內精密度 日間精密度測量值（mg/L） 準確度（%） 精密度（%） 測量值（mg/L） 準確度（%） 精密度（%）0.204 0.195±0.004 95.6 2.05 0.196±0.008 96.1 4.08 0.816 0.792±0.021 97.1 2.65 0.802±0.026 98.3 3.24 4.080 3.933±0.084 96.4 2.14 3.905±0.088 95.7 2.25

表2 5只雄性SD大鼠不同時間血藥濃度數據 （mg/L）

圖1 大鼠血漿樣品中蘆丁的HPLC色譜A.空白血漿；B.空白血漿加蘆丁對照品；C.灌胃柿葉提取物后的血漿樣品；1：蘆丁（保留時間約9.5 min）

圖2 柿葉提取物中蘆丁在大鼠體內的平均藥-時曲線（n=5； ）

表3 主要藥動學參數

3 討 論

本研究對血漿樣品處理方法進行了一系列篩選，嘗試了固相萃取法及有機溶劑蛋白沉淀法。通過比較發現固相萃取法提取回收率較低，且操作較蛋白沉淀法繁瑣，所以選定有機溶劑蛋白沉淀法。其中分別比較了甲醇、乙腈、6%高氯酸、三氯乙酸等有機溶劑，通過綜合比較雜質干擾及提取回收率因素，發現甲醇沉淀蛋白效果最好。同時考察了不同體積比的血漿-甲醇（1∶2，1∶3，1∶4）對蘆丁測定的影響，結果隨著甲醇體積比的加大，血漿雜質峰并無明顯減少，且隨著甲醇量的增大，樣品相應的稀釋倍數加大，不利于樣品的測定，故選定以血漿-甲醇（1∶2）作為沉淀蛋白條件。

試驗中對蘆丁進行了全波長掃描，發現蘆丁有3個特征吸收峰：分別為208、260和360 nm。208 nm近末端吸收，不利于樣品的檢測；檢測波長在260 nm處雜質峰較360 nm處強，故選擇360 nm作為蘆丁的檢測波長。

本研究表明大鼠灌胃柿葉提取物后蘆丁在大鼠體內藥動學過程符合二房室模型。通過吸收速率常數Ka=（2.436±0.883）/h，表明蘆丁在胃腸道能較快地被吸收，且灌胃后大鼠血漿中的蘆丁在1 h即達峰值Cmax=（1.658±0.184）mg/L，且分布速率常數α=（1.002±0.372）/h表明蘆丁進入大鼠體循環后能迅速地分布，從而迅速發揮藥效。另外，消除速率常數β=（0.083±0.067）/h和消除半衰期t1/2β=（9.418±7.256）h表明，蘆丁在體循環中消除較慢，這也提示在開發保健食品或者藥品時應合理設計服用間隔時間。

由于本研究對象為柿葉提取物，為柿葉中某一系列化合物的混合物，各個化學成分之間的相互作用都有可能導致蘆丁的吸收、分布及代謝等發生變化。文獻［5］報道蘆丁單體化合物靜脈注射后蘆丁在大鼠體內符合二室模型，與本研究一致，但其消除半衰期t1/2β為1.21 h，遠小于本研究的消除半衰期t1/2β的（9.418±7.256）h，可能原因在于由于其為單體化合物，而本研究對象為一系列復雜化合物的混合物，與蘆丁單體化合物相比，一方面混合物中的某些化合物可能會延緩蘆丁在體內的代謝過程，另一方面可能為混合物中的槲皮素類苷元在體內經過一系列變化轉化為蘆丁，從而導致其在體內的消除半衰期延長。本研究結果為柿葉的新藥開發及后續臨床給藥方案研究提供了實驗依據。

[1]國家中醫藥管理局《中華本草》編委會. 中華本草[M].上海:上海科學技術出版社，1999: 140-141.

[2]周鑫堂, 王麗莉, 韓 璐, 等. 柿葉化學成分和藥理作用研究進展[J]. 中草藥，2014, 45（21）: 3195-3203.

[3]辛 寧, 豐 杰, 姚 波. 柿葉黃酮類提取分離及藥理作用研究概況[J]. 中醫藥學報, 2007, 35（2）: 49-51.

[4]王 燕. 柿葉中黃酮類化合物的研究進展[J].亞太傳統醫藥, 2011, 7（4）: 173-174.

[5]楊子華. HPLC法檢測大鼠血漿中蘆丁濃度及其藥物動力學[J]. 中國藥師, 2012, 15（6）: 853-855.

（2015-08-04收稿 2015-09-02修回）

（責任編輯 付 輝）

Study on plasma concentration of rutin in extract of persimmon leaves in rats by HPLC and its pharmacokinetics

CHEN Yangfang. Institute for Drug Control of Yangzhong, Zhenjiang 212200, China

ObjectiveTo establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for measuring the concentration of rutin in extract of persimmon leaves in rats, and to study its pharmacokinetics.MethodsBlood sample were collected through venous plexus in rat eye at different time after oral administration of the extract of persimmon leaves. After liquid extraction with methanol, the concentration of rutin in plasma was measured. Then pharmacokinetics parameters were calculated by 3P97 program.ResultsThe results showed that plasma concentration-time curve of rutin in rats was coincided with two-compartment model, rutin was absorbed fast in rats. Peak concentration （Cmax） of rutin in rat plasma was （1.658±0.184） mg/L one hour after oral administration. The other main pharmacokinetic parameters were as follows: absorption rate constant （Ka） was （2.436±0.883）/h, distribution rate constant （α） was（1.002±0.372）/h, elimination rate constant （β） was （0.083±0.067）/h, elimination half time （t1/2β） was （9.418±7.256） h, area under the concentration-versus-time curve （AUC0-12） was （9.628±2.281） mg·h/L.ConclusionsHPLC method is accurate and sensitive, it is suitable for the pharmacokinetic study of rutin in extract of persimmon leaves in rats.

rutin; extract of persimmon leaves; pharmacokinetics; HPLC

R74

10.13919/j.issn.2095-6274.2015.10.009

陳楊芳，碩士，工程師，E-mail: 408785385@qq.com

212200 鎮江，江蘇省揚中市藥品檢驗所