凋亡相關因子對腦卒中影響機制的研究進展

詹宇豪，沈俊明，王智惠，王亞飛 綜述，張文麗 審校

凋亡相關因子對腦卒中影響機制的研究進展

詹宇豪1，沈俊明1，王智惠2，王亞飛1綜述，張文麗2審校

腦卒中是一種以腦血液循環障礙為主要表現的疾病，在腦卒中的發病過程中，腦細胞凋亡相關因子的動態表達與調控是目前神經病學領域研究的重要方向。筆者查閱相關文獻，綜述了Caspases蛋白家族、Bcl-2蛋白家族、細胞色素C（cytochrome complex，cyt-c）、即早反應基因c-fos、p53基因、Fas基因對腦卒中的重要作用及影響機制。

凋亡相關因子；腦卒中；影響機制

1 Caspases蛋白家族

研究者們通過對線蟲體細胞凋亡的研究，發現了哺乳動物中與線蟲細胞凋亡關鍵基因ced-3、ced-4、ced-9

腦卒中，又稱腦血管意外，是腦部出現出血性或缺血性損傷的臨床表現，多發于中老年人，病情兇險，嚴重者可致意識障礙、癡呆、肢體癱瘓甚至死亡，該病也是高血壓患者的主要致死原因。腦卒中發病后，缺血中心區神經元主要發生不可逆性死亡，而周圍缺血半暗帶區神經元損傷的主要形式為凋亡[1]。細胞凋亡是機體在生長、發育和受外界刺激時，清除衰老、損傷細胞以保持機體正常功能的一種自我調節機制。大量研相對應的同源基因Caspases、Apaf-1及Bcl-2。Caspases蛋白家族是一組半胱氨酸蛋白酶，在哺乳動物細胞凋亡過程中居于核心地位[4]。細胞中合成的Caspase以無活性的酶原狀態存在，經細胞內、外兩種途徑激活后發生級聯反應，特異水解多種胞漿底物，并將信號傳入細胞核，引起其凋亡。其中，細胞外途徑由隸屬腫瘤壞死因子（tumor necrosis factors，TNF）/神經營養因子（nerve growth factor，NGF）受體亞家族的細胞表面死亡受體的配體啟動，而細胞內途徑與線粒體釋放cyt-c有關。細胞凋亡包括Caspase依賴性和非Caspase依賴性兩種途徑；Caspases蛋白分為兩類：一類是上游啟動蛋白，如Caspases-8、9等，它們可以裂解并激活其他Caspases蛋白；另一類是下游效應蛋白，如Caspase-3、6、7，它們可以裂解底物蛋白，分解細胞結構或使酶失活；在Caspases蛋白家族中，Caspase-1、4、5主要在炎性反應中起作用，Caspase-2、3、8、9、10則與細胞凋亡密切相關；活化的Caspase蛋白可以使線粒體外膜的通透性改變，干擾電子在線粒體膜上的運輸，導致膜電位變化，進而釋放促凋亡因子[5,6]。其中被稱為“劊子手”蛋白酶的Caspase-3，在凋亡過程中至關重要。

Caspase-3與線蟲細胞凋亡所必需的ced-3基因同源性最高，是哺乳動物細胞凋亡的關鍵執行者。凋亡的早期階段，活化的Caspase-3引起一系列級聯反應，在兩條凋亡途徑中扮演下游效應分子的作用，一旦被激活，則引起下游級聯反應，通過酶解滅活凋亡抑制物、酶解細胞外基質及骨架蛋白、裂解DNA修復相關分子等最終引起細胞凋亡[7]。故Caspase-3也被稱為“凋亡蛋白酶”。作為多種凋亡刺激信號傳導的交匯點，Caspase-3的活化可視為凋亡進入不可逆階段的標志，也是直接導致凋亡細胞解體的蛋白酶系統。研究者們用大鼠建立了永久性大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，發現腦卒中大鼠腦組織Caspase-3表達增高，證明了Caspase-3的表達水平直接反映細胞凋亡情況[8]。Zhou L等[9]研究丹參酮IIA對短暫性局灶性腦缺血組織的神經保護作用，發現Caspase-3和Caspase-8的表達受到抑制，腦梗死面積明顯減少。 劉杰等[10]采用大鼠自體血栓制作大腦中動脈梗死模型，研究超過溶栓時間窗的急性腦梗死溶栓治療對大鼠腦組織Caspase-3表達的影響，發現6 h溶栓組比對照組表達明顯減少，減輕了細胞凋亡。相反，腦卒中時接受不良刺激如吸煙引起腦缺血半暗帶區Caspase-3表達及活性異常增加，則可加重腦缺血損傷誘導的細胞凋亡，具有加速神經細胞壞死的作用[11]。

2 Bcl-2蛋白家族

Bcl-2即B細胞淋巴瘤/白血病基因-2，自1984年首次從濾泡性B細胞淋巴瘤中分離以來，其抗凋亡作用逐漸成為研究熱點。Bcl-2家族包含一組相關蛋白，根據其作用分兩類：一類起抗凋亡作用，包括Bcl-2、Bcl-xl等；另一類起促凋亡作用，包括Bax、Bak、Bid等。其中Bcl-2、Bcl-xl、Bax家族各成員之間可以形成同源或異源二聚體，通過它們之間的相互作用，在細胞凋亡途徑的上游遠端構成了一個重要的細胞內凋亡調控點。目前研究證明，Bcl-2蛋白分布于內質網表面及核膜，線粒體外膜的漿膜面，可以穩定線粒體膜，防止線粒體釋放Caspase、凋亡誘導因子和cyt-c等[12]；封閉Bax形成孔道的活性，從而抑制細胞的凋亡，Bcl-2/Bax的比值決定了腦卒中細胞是否進入凋亡程序。近年來，部分學者研究多種作用于Bcl-2蛋白家族的藥物，通過改變其表達及比值，來闡述其在腦缺血治療中的作用。宋先紅等[13]觀察發現腦通湯可作用于腦卒中后大鼠海馬神經元，使得抑制凋亡基因Bcl-2增多、促進凋亡基因Bax表達減少，Bcl-2 / Bax比例明顯增高，神經元凋亡減少，從而使海馬神經血管單位得到整體改善，這也印證了Bcl-2蛋白家族在腦卒中的重要修復作用。Cho Y S等[14]采用沙土鼠腦缺血模型研究烏司他丁對缺血損傷器官的保護作用。結果顯示在缺血的海馬組織中，Bax表達增加，Bcl-2表達降低，而經過治療后，Bcl-2/ Bax的比例發生了逆轉，這明顯改善了海馬細胞凋亡情況，有效改善了腦缺血狀態。以上均表明Bcl-2蛋白家族在腦缺血相關疾病的治療中發揮著至關重要的作用。

3 cyt-c

cyt-c是線粒體呼吸鏈中傳遞電子的載體。在研究細胞凋亡時發現的DNA片段（即凋亡片段）依賴于某種細胞器碎片的存在，并在細胞胞漿中提取出3種成分，分別被稱作凋亡蛋白激活因子1～3（apoptosis protease activating factor，Apaf 1～3），其中Apaf 2就是cyt-c[13]。cyt-c本身就能誘導細胞發生凋亡，也可與外源性cyt-c和ATP協同發揮作用而促使細胞凋亡。腦卒中缺血缺氧后，隨著線粒體呼吸活性的喪失，cyt-c自線粒體內釋放到細胞質，與Apaf-1結合形成寡聚體，進一步激活Caspase-9、Caspase-3，破壞細胞的基本結構和重要蛋白，導致凋亡小體產生。邢變枝等[15]發現大鼠腦缺血再灌注損傷后cyt-c表達增高，表明cyt-c進入細胞質是腦卒中細胞凋亡過程的關鍵步驟。劉慶杰等[16]觀察烏司他丁對局灶性腦缺血-再灌注大鼠腦組織cyt-c及凋亡細胞數的影響，結果對照組和治療組大鼠腦組織皮質區cyt-c的表達及凋亡細胞數均明顯高于假手術組（P＜0.05），表明cyt-c表達降低，能減輕線粒體損傷，抑制線粒體通路的凋亡途徑。Huang X P等[17]通過對小鼠雙側頸總動脈閉塞后進行再灌注，發現在缺血再灌注48 h后，神經細胞的存活率升高、凋亡率減低，其可能機制為降低cyt-c，caspase-3、9的表達，進一步抑制線粒體的凋亡途徑。

4 即早反應基因c-fos

在原癌基因家族中，有一類能被第二信使所誘導的原癌基因，被稱為“即刻早期基因”（immediately early genes，IEGs），又稱快速反應基因。IEGs家族中具有代表性且研究較為深入的主要是c-fos和c-jun家族，其中以c-fos轉錄、激活最快，活性最高。正常情況下c-fos、c-jun在神經元中僅是低水平的表達，而在腦缺血等病理情況下卻被快速地誘導高表達，其產物fos、jun通過亮氨酸拉鏈形成同源或異源二聚體復合物，該復合物調節后期反應基因的表達，間接參與對腦功能活動的信號轉導和調控過程。c-fos表達產物（c-fos mRNA和c-fos蛋白）常作為細胞對缺血反應的敏感標志物，近年來其與腦外傷、癲癇、腦血管病等神經系統疾病的關系研究越來越多。Zheng W等[18]運用彌漫性腦損傷模型觀察c-fos和c-jun表達的變化，結果顯示腦損傷后1 h c-fos和c-jun表達即開始增加，其中c-fos在傷后3 h達到高峰，隨后降低并于傷后3 d達到最高水平，傷后7 d明顯降低較對照組仍維持在較高水平；c-jun陽性細胞在傷后6 h數量達到最多，隨后減少并于傷后3 d達到最高水平，之后明顯降低但與對照組相比仍維持在較高水平，說明c-fos和c-jun表達在腦損傷后隨時間發生變化。毛曉霞等[19]以四血管阻斷法建立全腦缺血再灌注損傷模型，發現藥物干預降低c-fos與c-jun表達后，凋亡神經細胞明顯減少。這些研究提示腦損傷后抑制c-fos與c-jun 基因的高表達，有利于減少腦卒中后神經元的凋亡。

5 p53基因

p53是腫瘤抑制基因，存在于細胞內的正常狀態為野生型，其產物主要存在于細胞核內，是各種遺傳毒性應激的感受因子，具有與單鏈或雙鏈DNA結合的能力，與細胞分裂周期有關，對防止細胞增生和保持DNA受損基因組的完整性有重要作用，是腦卒中后的關鍵調控因子。腦缺血、缺氧等使腦細胞處于應激狀態，DNA受損，p53介導下游基因表達，引起細胞凋亡[20]。研究表明，腦缺血后神經細胞凋亡同時伴有p53 基因表達上升[21,22]。改變Bcl-2/Bax比值，使cyt-c從線粒體轉移至胞質繼而引發Caspases家族級聯反應可能是p53促凋亡的主要作用機制。顏玲等[23]發現抑制p53基因的表達，可明顯改善腦缺血再灌注神經功能損傷和抑制神經元凋亡。Filichia E等[24]利用基因敲除技術使小鼠前腦神經元p53基因缺失，發現MCAO后，p53基因敲除小鼠腦梗死體積小且運動障礙程度更低。這些研究提示抑制p53基因表達則可抑制神經元凋亡，改善神經功能，減輕缺血性損傷。

6 Fas基因

Fas基因又稱CD95或apo-l，屬于TNF/NGF受體超家族成員，是外源性凋亡途徑重要的促凋亡基因。Fas、Fas相應配體和Caspase-8的前體，共同組成死亡誘導信號復合體，可激活Caspase-8，類似凋亡復合體可引起Caspase級聯反應，降解胞內結構蛋白和功能蛋白，誘導腦卒中細胞凋亡發生[25]。生理狀態下Fas在免疫系統及肝、腎、心、肺、皮膚等組織有較高水平的表達，在大腦少量表達或不表達，但腦缺血可誘發Fas基因高表達。研究發現腦缺血缺氧損傷后的6～12 h Fas表達達到高峰，并且在受損傷的部位尤為明顯，說明Fas在腦缺血缺氧后神經細胞的凋亡中起重要作用[26]。Fas表達障礙的MRL/lpr小鼠，對缺血缺氧性腦損傷具有耐受能力，局灶性腦缺血后的腦梗死體積較野生型小鼠顯著縮小。實驗表明，下調Fas及Fas配體的表達，腦梗死體積顯著縮小[27,28]。這提示，Fas促進了腦缺血后神經細胞的凋亡過程，而抑制其表達則可從外源性凋亡途徑抑制神經細胞凋亡繼而對腦組織產生積極效應。

7 小 結

細胞凋亡是一個十分復雜的過程，包括多個通路，許多相關因子共同參與的信號轉導，其病理過程，機制尚未完全清楚。目前國內外對于腦缺血損傷以及藥物抗腦缺血的研究較多，深入研究凋亡相關因子的作用，探討細胞凋亡機制，將為解決神經細胞凋亡這一主要矛盾提供新的靶點，進而更好地治療腦卒中等腦缺血疾病，尚需同道們不懈努力。

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（2015-06-30收稿 2015-09-21修回）

（責任編輯 付 輝）

Research progress of apoptosis related factors on the underlying mechanism of stroke

ZHAN Yuhao1, SHEN Junming1, WANG Zhihui2, WANG Yafei1, and ZHANG Wenli2. 1. Acupuncture and Massage Specialty，College of Traditional Chinese Medicine, 2. Medical Research Center, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000，China

Stroke is characterized by the sudden loss of cerebral blood circulation. In the pathology course of stroke, dynamic expression and regulation of apoptosis related factors in brain have become an important direction of current research in the field of neurology. The author reviewes related literatures and summerizes important effects and underlying mechanism of apoptosis family on stroke, such as Caspases protein family, Bcl-2 protein family, cytochrome complex(cyt-c), early response gene c-fos, p53 gene and Fas gene.

apoptosis related factors; stroke; underlying mechanism究表明[2,3]，細胞凋亡是細胞自發引起的死亡過程，其過程受嚴格程序的基因調控，又被稱為細胞程序性死亡，在清除機體衰老細胞、維持機體正常生理平衡以及多種疾病過程中起著非常重要的作用。在諸多凋亡相關因子中，Caspases蛋白家族是細胞凋亡的主要的執行者，Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡信號轉導的主要調節者，cyt-c從線粒體釋放是細胞凋亡的關鍵步驟，即早反應基因c-fos是細胞對缺血反應的敏感標志之一，p53基因，Fas基因是腦卒中后的關鍵調控因子。利用凋亡相關因子的作用機制對腦卒中進行干預治療，是當今腦卒中研究的重要方向與途徑。筆者綜述了腦卒中病程發展過程中細胞凋亡相關因子發揮的作用及其影響機制。

R743.3

10.13919/j.issn.2095-6274.2015.10.015

大學生創新創業計劃項目（校級編號x2014008，省級國家級編號201410081030）；河北省中醫藥局項目（2014058），唐山市科技局項目（13130293z）；國家科技部老年醫學國際科技合作基地項目（14160201B）；唐山市老年醫學重點實驗室項目（14140221B）

詹宇豪，本科在讀，E-mail： 815152835@qq.com

063000 唐山，華北理工大學：1.中醫學院針灸推拿專業，2.醫學實驗研究中心

張文麗，E-mail： dianj@163.com