高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物肝臟中20種全氟烷基類化合物

何建麗+彭濤+謝潔+代漢慧+陳冬東+岳振峰+范春林+李存

摘 要 建立了QuEChERs-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）同時測定動物肝臟中20種全氟烷基類化合物（Perfluorinated alkyl substances， PFAS）殘留量的分析方法。樣品用0.1% HCl-乙腈振蕩提取，C18、N-丙基乙二胺（PSA）和石墨化碳黑（GCB）凈化，在C18色譜柱，以5 mmol/L NH4Ac甲醇溶液和5 mmol/L NH4Ac溶液為流動相進行梯度洗脫。多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）負離子模式，采用基質(zhì)匹配同位素內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法結(jié)合進行定量分析。20種PFAS在0.1～10 μg/L濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)不小于0.995;檢出限為0.05～0.2 μg/kg，定量限為0.4～0.5 μg/kg。動物肝臟中20種PFAS的3個濃度水平（0.5， 2和5 μg/kg）加標(biāo)的平均回收率為70.3%～108.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2.1%～11.9%（n=6）之間。

關(guān)鍵詞 全氟烷基類化合物;QuEChERs;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;動物肝臟

1 引 言

全氟烷基類化合物（PFAS）是一類具有重要應(yīng)用價值的含氟有機化合物，含有極高化學(xué)鍵能（約為110 kcal/mol）的〖JG（〗C〖ZJY〗F〖JG）〗共價鍵，其穩(wěn)定性高，具有疏油、疏水等特性，被廣泛應(yīng)用于紡織、造紙、包裝、農(nóng)藥、地毯、皮革、洗發(fā)香波和滅火泡沫等工業(yè)和民用領(lǐng)域^[1]。PFAS能夠經(jīng)受很強的熱、光照、化學(xué)、微生物作用和高等脊椎動物的代謝而不降解^[2]，可以隨食物鏈的傳遞在生物機體內(nèi)富集和放大至相當(dāng)高的濃度^[3，4]，PFAS在生物體內(nèi)的蓄積水平高于已知的有機氯農(nóng)藥和二惡英等持久性有機污染物的數(shù)百至數(shù)千倍^[5]。 研究發(fā)現(xiàn)，PFAS具有誘發(fā)肝中毒、發(fā)育毒性、免疫毒性、內(nèi)分泌干擾以及潛在致癌性等毒理效應(yīng)^[6，7]。2006年，歐盟議會通過決議，規(guī)定歐盟市場上全氟辛烷磺酸在配制品中的含量不得超過產(chǎn)品質(zhì)量的0.005%，半成品中不得超過0.1%，紡織品或塗料中不得超過1 μg/m2， 標(biāo)志著歐盟正式全面禁止全氟辛烷磺酸在商品中的使用^[8]。PFAS主要分布于動物的血液、肝臟、腎臟、心臟和肌肉等組織中，并以血液和肝臟中濃度最高。因此，建立快速、靈敏、準(zhǔn)確地測定動物肝臟中PFAS的方法尤為重要。

目前，檢測PFAS的常用方法是高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS），樣品前處理多采用液液萃取或離子對試劑提取，WAX固相萃取柱[9～12]凈化。傳統(tǒng)的前處理方法步驟繁瑣、耗時長，方法重現(xiàn)性不好。相比之下，以基質(zhì)分散固相萃取為基礎(chǔ)的QuEChERs（Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe）方法因其具有靈敏、高效、快速等特點，近年來被廣泛應(yīng)用。

HPLC-MS/MS技術(shù)具有高的靈敏度、選擇性和重現(xiàn)性，是目前分析PFAS常用的方法^[13]。根據(jù)動物肝臟基質(zhì)的特點，本研究采用QuEChERS方法對樣品進行提取和凈化，采用基質(zhì)匹配同位素內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法結(jié)合進行定量分析，建立了基質(zhì)校正HPLC-MS/MS同時測定動物肝臟中20種PFAS殘留量的分析方法。本方法簡單、實用性強、分析速度快，可廣泛用于動物類樣品中PFAS的分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLCTM超高效液相色譜儀配TQD三重四級桿質(zhì)譜儀（Waters公司）;D160均質(zhì)/分散機（Dragon Lab公司）;TRIO TM-1N型旋渦混合器（AS ONE公司）;SR-2DS型水平振蕩器（TATEC公司）;3-30K型高速冷凍離心機（Sigma公司）;N-EVAP 112型氮吹儀（Organomation Associates公司）;Milli-Q超純水儀（Millipore公司）;KQ-600B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

全氟丁酸、全氟戊酸、全氟丁烷磺酸鉀、全氟己酸、全氟庚酸、全氟己烷磺酸鈉、全氟辛酸、全氟庚烷磺酸鈉、全氟壬酸、全氟辛烷磺酸鈉、全氟癸酸、全氟癸烷磺酸鈉、全氟十一烷酸、全氟十二烷酸、全氟十三烷酸、全氟十四烷酸、全氟十六烷酸、全氟十八烷酸、全氟壬烷磺酸鈉、全氟戊烷磺酸鈉和同位素內(nèi)標(biāo)13C4-全氟丁酸、13C2-全氟己酸、18O2-己烷磺酸鈉、13C4-全氟辛酸、13C4-辛烷磺酸鈉、13C5-全氟壬酸、13C2-全氟癸酸、13C2-十一烷酸、13C2-十二烷酸混合內(nèi)標(biāo)（Wellington公司）;甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）;乙酸銨（色譜純，Acros Organics公司）;C18（CNWBOND HC-C18，40～63 μm，CNW公司），N-丙基乙二胺（PSA，40～60 μm，艾爾杰公司），石墨化碳黑（GCB，CNWBOND Carbon-GCB，120～400目，CNW公司），實驗用水為Milli-Q超純水，其它未作特殊說明的試劑均為分析純。

為防止引入高背景值，實驗過程避免使用聚四氟乙烯材質(zhì)的色譜管路和器皿。

2.2 樣品預(yù)處理

2.2.1 提取 準(zhǔn)確稱取2.00 g牛肝勻質(zhì)樣品置于50 mL離心管中，加入適量內(nèi)標(biāo)，再加入4 mL超純水，漩渦混合1 min后，加入0.1%鹽酸乙腈10 mL，均質(zhì)1 min后振搖10 min，加入2 g NaCl，再次振搖10 min，13000 r/min離心10 min。取上層乙腈相于15 mL離心管中，40 ℃下氮吹約至4 mL，以乙腈定容至4 mL，待凈化。endprint

2.2.2 凈化 將上述溶液轉(zhuǎn)移至裝有80 mg C18、100 mg PSA和40 mg GCB填料的離心管中，振搖10 min后， 13000 r/min離心10 min，取上清液（約4 mL）于另一離心管中，40 ℃下氮氣吹至干，以1 mL甲醇定容后， 過0.22 μm濾膜，HPLC-MS/MS分析。

2.2.3 HPLC-MS/MS分析條件 液相色譜條件：Atlantis T3色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）;柱溫：38 ℃;流速：0.2 mL/min;進樣量：10 μL;流動相：A為5 mmol/L NH4Ac-甲醇溶液，B為5 mmol/L NH4Ac溶液;洗脫梯度：0～3 min，10%～30% A;3～13 min，30%～100% A;13～14 min，100%～10% A;14～20 min， 10% A。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）;多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）;負離子模式;毛細管電壓： 3.0 kV;源溫度：120 ℃;去溶劑氣流：氮氣，650 L/h;去溶劑溫度：350 ℃;錐孔氣流：氮氣，100 L/h;碰撞氣壓：氬氣，2.4×10 Symbolm@@ 6 Pa。其它參數(shù)見表1。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線2.3.1 外標(biāo)曲線 以陰性空白牛肝樣品提取液（操作同2.2節(jié)，但提取步驟不加內(nèi)標(biāo)溶液）作為溶劑，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成0.1， 0.5， 1， 2， 5和10 μg/L系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，以待測物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)， 繪制外標(biāo)曲線。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)曲線 步驟同2.4.1節(jié)，其中每份標(biāo)準(zhǔn)溶液內(nèi)都含1 μg/L內(nèi)標(biāo)，以待測物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子質(zhì)量色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)， 繪制內(nèi)標(biāo)曲線。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

PFAS同時具有親水性和疏水性，采用較低硅羥基活性填料的C18反相色譜柱可實現(xiàn)這類化合物的良好分離[14～16]。通過對Waters XTerra C18柱、Capcell Pak C18和Atlantis T3 C18色譜柱進行對比，發(fā)現(xiàn)Atlantis T3 C18的峰形與分離度效果最佳。流動相選取乙腈-水、甲醇-水等進行比較，結(jié)果表明， 以甲醇-水作為流動相， 化合物分離度更好。所測PFAS都是羧酸或者磺酸鹽，在流動相中加入NH4Ac能使其保持一定的pH值及離子強度，減少拖尾，改善峰形^[17]，有研究表明， 較高濃度的NH4Ac對質(zhì)譜檢測有較強的抑制作用^[18]。因此，經(jīng)過優(yōu)化后，本實驗采用Atlantis T3 C18型色譜柱，以5 mmol/L NH4Ac甲醇溶液和5 mmol/L NH4Ac溶液進行梯度洗脫（梯度洗脫條件見2.3節(jié)），20種目標(biāo)物在20 min內(nèi)可實現(xiàn)良好分離，保留時間見表2。PFOA和L-PFOS的標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖見圖1。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于目標(biāo)物帶有SO2 Symbolm@@ 3，難于質(zhì)子化，不宜采用ESI+模式，故本實驗選取ESI Symbolm@@ 模式進行掃描。用針泵以20 μL/min的流速分別注入100 μg/L PFAS標(biāo)準(zhǔn)溶液，在m/z 200～1000掃描范圍內(nèi)， 以負離子模式進行一級質(zhì)譜掃描，發(fā)現(xiàn)PFAS化合物峰較強，大部分化合物以電離后失去羧基上氫原子為主。確定分子離子后，分別以其作為母離子，進行子離子掃描，選取豐度最強碎片離子作為定量離子，次強的碎片離子作為定性離子。部分化合物打碎后的碎片離子少，只能找到一個離子。最后，以選擇反應(yīng)監(jiān)測（MRM）負離子模式優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)，質(zhì)譜條件見表1。

3.3 提取溶劑的選擇

PFAS屬于酸性化合物，在酸性環(huán)境下呈分子狀態(tài)，有利于進入有機相。已報道的文獻中采用0.1% HCl-甲醇溶液^[19]、乙腈^[20]、2%甲酸-甲醇溶液^[21]等作為提取溶劑，提取尿液^[13]、奶粉^[19]和肝臟^[21]等基質(zhì)中PFAS。在參考文獻的基礎(chǔ)上，本實驗分別用乙腈、甲醇、0.1% HCl-乙腈溶液、2%甲酸-甲醇溶液、0.1%HCl-甲醇溶液、2%甲酸-乙腈溶液作為提取溶劑，比較不同提取溶劑對目標(biāo)物的提取效率。結(jié)果表明，用0.1% HCl-乙腈溶液提取的效率最好，在1 μg/kg 加標(biāo)水平下， 目標(biāo)物的平均回收率為85.3%～117.2%，且不同目標(biāo)物之間無明顯差異，結(jié)果見圖2。最后，選擇0.1% HCl-乙腈溶液為提取溶劑。

3.4 凈化方式的選擇

動物肝臟中存在色素、脂肪、甾醇等雜質(zhì)，PSA可以吸附基質(zhì)中的碳水化合物、有機酸和酚類，C18可以去除脂肪和酯類等，GCB可以去除色素、甾醇類等。吸附劑粉末的用量直接影響前處理凈化效果和目標(biāo)物的回收率，用量小則凈化效果不明顯，用量大，凈化效果雖好，但回收率低，不能滿足檢測要求，為選擇合適的吸附劑粉末的用量，比較了3種不同的吸附劑凈化的樣品回收率。

用C18凈化樣品后的平均回收率大于80%，但重現(xiàn)性不好，且凈化后的溶液有色素殘留;PSA和GCB凈化色素效果較好，但凈化后的溶液有油脂殘留。為了解決以上難題，使用以上3種吸附劑的組合，在檢測靈敏度、最佳凈化效果和合理回收率之間尋求平衡點，使全部化合物獲得滿意的結(jié)果。實驗對不同比例PSA、C18、GCB（1∶1∶1，2∶2∶1，2.5∶2∶1，3∶2∶1，w/w）的凈化效果進行了考察（圖3），結(jié)果表明，以2.5∶2∶1的質(zhì)量比混合3種吸附劑PSA、C18、GCB獲得最佳凈化效果，20種PFAS平均回收率能達到73%～112%，背景值干凈，加標(biāo)樣品的分離度和峰形均較好。因此，選擇混合吸附劑（PSA， C18， ?GCB，2.5∶2∶1， w/w）為凈化吸附劑。endprint

3.5 基質(zhì)效應(yīng)

以陰性空白牛肝樣品提取液作為溶劑，配制1 μg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其峰面積為A;以甲醇為溶劑配制1 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測定其峰面積為B?；|(zhì)效應(yīng)ME（%）=B/A×100^[22]，結(jié)果見表3。其中ME>100%的為基質(zhì)增強效應(yīng)，ME<100%的為基質(zhì)抑制效應(yīng)?？梢钥闯觯瑯悠诽崛∫簩Σ糠帜繕?biāo)化合物存在一定的基質(zhì)影響。為保證定量分析準(zhǔn)確性，本方法選擇基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定。

3.6 定量方式及線性關(guān)系

在檢測PFAS的過程中，通常情況下由于待測樣品中PFAS的含量較低，因此在檢測技術(shù)不夠穩(wěn)定以及儀器靈敏度有所限制的條件下，采用外標(biāo)法定量測定會產(chǎn)生較大的誤差，而內(nèi)標(biāo)法的使用會使這一問題迎刃而解，可最大限度地減少由儀器響應(yīng)度所引起的誤差^[5]。同時，由于存在基質(zhì)效應(yīng)，因此實驗中以空白牛肝樣品提取液作為溶劑配制混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。L-PFHpS、PFTrDA、L-PFPeS未尋找到性質(zhì)相同的同位素內(nèi)標(biāo)，采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法，其它17種PFAS采用基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)法進行定量分析，結(jié)果見表4。

在陰性樣品中添加目標(biāo)化合物，按照給定的方法測定，以3倍信噪比（S/N）對應(yīng)的添加水平作為檢出限（LOD），10倍信噪比（S/N）對應(yīng)的添加作為定量限（LOQ），結(jié)果見表4。結(jié)果表明，本方法LOD在0.05～0.2 μg/kg之間，LOQ在0.4～0.5 μg/kg之間。

3.7 準(zhǔn)確度和精密度

實驗選擇1倍、4倍和10倍LOQ作為添加量，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。選取陰性牛肝為空白樣品，分別添加相當(dāng)于0.5， 2和5 μg/kg濃度的PFAS混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本方法進行測定，每個濃度6個平行。同時做空白實驗，均扣除本底值后計算添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。PFAS在牛肝中的添加回收率為70.3%～108.1%，RSD在2.1%～11.9%范圍內(nèi)，結(jié)果見表5。3.8 實際樣品分析

應(yīng)用本方法測定60份市售牛肝樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實際樣品中檢出PFDA、L-PFHxS、L-PFOS，含量在0.6～0.9 μg/kg，其余各組分均未檢出，實際檢出率低于7.3%。長鏈PFAS檢出率較高，在肝臟組織中富集明顯且普遍。圖4為陽性牛肝樣品中檢出的3種PFAS的MRM色譜圖。

4 結(jié) 論

本實驗通過對儀器檢測參數(shù)和樣品前處理條件的優(yōu)化，采用基質(zhì)匹配同位素內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法結(jié)合定量，首次建立了基質(zhì)校正HPLC-MS/MS同時測定動物肝臟中20種PFAS殘留量的分析方法。方法簡單、快速、靈敏度高、準(zhǔn)確度好、溶劑消耗量少， 且有效克服了基質(zhì)干擾問題，可廣泛用于動物類樣品中PFAS的測定。

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Development of a QuEChERs Method for Determination of 20endprint

Perfluorinated Compounds in Animal Liver by HPLC-MS/MS

HE Jian-Li1，2， PENG Tao*2， XIE Jie3， DAI Han-Hui2， CHEN Dong-Dong2，

YUE Zhen-Feng4， FAN Chun-Lin2， LI Cun*1

1（Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

2（Chinese Academy of Inspection & Quarantine， Beijing 100123， China）

3（College of Veterinary Medicine， China Agricultural University， Beijing 100083， China）

4（Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Shenzhen 518033， China）

Abstract A method for simultaneous determination of 20 Perfluorinated alkyl substances （PFAS） in animal liver using QuEChERs and HPLC-MS/MS technique was developed. The samples were extracted with 0.1% hydrochloric acetonitrile and cleaned up with C18， N-Propylethylendiamine （PSA） and graphitized carbon blacks （GCB）. The analytes were separated by a reversed phase C18 column and gradiently eluted with a mixed solution of 5 mmol/L ammonium acetate methanol and 5 mmol/L ammonium acetate. The samples were quantified using isotope internal standard and external standard with the matrix matched standard calibration curve method. Good linearity was obtained for all the 20 PFAS at the concentration of 0.1-10 μg/L with the linear correlation coefficients more than 0.9995. The limits of detection （LOD） and the limits of quantification （LOQ） for PFAS were 0.05-0.2 μg/kg and 0.4-0.5 μg/kg， respectively. The recoveries at three different concentration levels （0.5， 2 and 5 μg/kg） were in the range of 70.3%-108.1%. The repeatability expressed as relative standard deviations （RSD） was ranged from 2.1% to 11.9% （n=6）.

Keywords Perfluorinated alkyl substances; QuEChERs; ?High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Animal liver

（Received 29 July 2014; accepted 19 September 2014）endprint