抗瓜氨酸蛋白抗體在類風濕關節炎中的研究進展

朱林文思

抗瓜氨酸蛋白抗體在類風濕關節炎中的研究進展

朱林文思

類風濕關節炎（RA）是一種常見的慢性自身免疫病，主要表現為炎癥和關節損傷。RA的早期診治能避免病情加重和關節不可逆損傷。1988年首次發現RA患者體內存在抗瓜氨酸化蛋白抗體（ACPA）［1］。2000年國外學者成功合成人工抗原環瓜氨酸肽（CCP），并利用ELISA方法在RA患者體內檢測到抗CCP抗體，此后大量研究結果顯示抗CCP抗體對RA具有較高的敏感性和特異性。2010年ACPA被美國風濕病學會（ACR）/歐洲抗風濕病聯盟（EULAR）納入RA診斷標準。ACPA存在于RA臨床發病之前，并與RA病情的進展和預后明顯相關。

1　抗瓜氨酸蛋白抗體的生成

瓜氨酸化蛋白是蛋白質翻譯后修飾的一種形式。在Ca2+濃度＞10-5mol/L的條件下，肽酰基精氨酸脫亞氨酶（PAD）催化蛋白中的精氨酸殘基脫亞氨基，轉變為瓜氨酸殘基，這種改變導致蛋白質隨帶正電荷減少，蛋白質分子內部結構發生變化，使原本隱藏于分子內的基團暴露，被吞噬清除，加速細胞死亡。此過程只出現在凋亡或壞死的細胞內，一般并不會引起免疫系統反應。但當清除系統無效或能力不足時，PAD酶和瓜氨酸蛋白就引起免疫反應。被釋放的PAD酶，主要是PAD2和PAD4酶，其修飾關節滑膜組織中的膠原和纖維蛋白原含有的精氨酸蛋白，產生大量的多樣化的瓜氨酸抗原［2］。因此在導致大量細胞死亡的炎癥反應過程中，均可檢測到瓜氨酸蛋白抗原，與是否RA有關。然而，在正常人體內瓜氨酸蛋白質的少量存在極少誘導機體產生ACPA，而在RA患者中則較為常見，此抗體的產生與患者的遺傳背景和環境因素有明顯關系。

2　影響抗瓜氨酸蛋白抗體產生的因素

根據ACPA產生的途徑，T細胞對抗原表位的識別，B細胞的活化，PADI4酶的活性以及全身免疫反應水平等的改變均可以影響抗體的產生。一般認為ACPA的產生由遺傳背景和環境因素兩方面所影響。

2.1遺傳背景 研究證明，HLA-DR4分子提供抗原至CD4+的T細胞過程系RA關節炎癥啟動的主要環節，活化的免疫活性細胞產生大量的細胞因子，如IL-1，IL-6和TNF-α，這些細胞因子可刺激成纖維細胞、上皮組織及間質細胞釋放基質金屬蛋白酶而破壞結締組織，刺激上皮細胞上調粘附分子（ICAM-1及VCAM-1）的表達，促使炎性細胞侵入關節滑膜而發生免疫反應［3］。

HLA-DRB1基因對RA遺傳易感影響力約30%［4］，其β鏈存在一段共同序列（QK/RRAA），稱為RA共同表位（SE），是HLA-DRB1抗原結合槽的主要構成序列。自身抗原可能通過與該抗原結合槽結合而被遞呈。抗CCP抗體的產生是受HLA限制性的，瓜氨酸化修飾的酶PADI4的某些SNPs基因型與RA的發生有關［5］。Hill等［6］研究證實肽鏈精氨酸轉化為瓜氨酸后增加了與HLA-DRB1 SE的親和力，進而誘導T細胞成熟，輔助B細胞的分化和成熟，產生ACPA。以瓜氨酸化纖維蛋白原免疫DR4.IE轉基因鼠可產生關節炎，而非瓜氨酸化纖維蛋白原或免疫野生型C57BL/6則不能。

蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22（PTPN22）是編碼淋巴特異性蛋白酪氨酸磷酸酶（LYP）的基因。LYP在維持細胞免疫穩態中起關鍵作用。研究顯示PTPN22（R620W）與ACPA陽性RA相關［7］。ERBB3是表皮生長因子（EGF）受體酪氨酸激酶家族成員。ERBB3位于在CD11c+細胞（單核細胞和樹突狀細胞），參與抗原遞呈，激活T細胞的增殖。近期研究顯示，ERBB3基因中rs2271189與RA的發病有正相關性［8］。由于各種群存在基因背景差異，不同種族背景ACPA陽性人群的基因也有所不同。研究中發現［5］，日本人染色體lp36上的NT2034367.1區域的4個PADl4基因的SNP外顯子SNP（PADl4-89、PADl4-90、PADl4-92、PADl4-104）單倍體型與RA易感性相關。在日本和韓國等亞裔的報道中也證實上述結果。但在歐美裔人群卻發現雖存在SNP多態性，卻與RA易感性無關。漢族人群有報道SNP（PADl4-89、PADl4-90和PADl4-104）與RA易感性相關［9］。同時發現中國人RA滑膜中PADl4 mRNA高水平轉錄。但也有研究者認為只有2個SNP（PADl4-89和PADl4-104）與RA易感性相關［10］。同時攜帶SE和PABl4-89 G+、PADl4-92 G+和PADl4-104T+中任一個SNP少見基因型均明顯增加發生RA的風險性［7］。提示兩者可能存在一定協同作用。

2.2環境因素 研究顯示基因和環境因素相互作用與RA發病相關［11］。煙草暴露（TE）是RA眾所周知的主要環境危險因素。且開始TE年齡及TE年數與RA有關，TE年齡越早，TE年數越長，患RA的危險性越大。不僅因TE在整體上危害身體健康，TE還與ACPA的產生相關。SE、TE和ACPA抗體的關系是通過CD4+T細胞的作用，影響瓜氨酸化蛋白介導的B細胞，從而影響ACPA的水平［12］。研究顯示，TE僅在帶SE的患者中是危險因素。TE可能觸發針對瓜氨酸蛋白的免疫反應，可能是通過誘導瓜氨酸化支氣管肺泡的受損細胞［13］。一旦對瓜氨酸化蛋白的耐受被打破，TE就可通過T細胞或B細胞免疫反應識別其他HLA分子。比較健康TE者和肺炎TE者的支氣管肺泡細胞可知，TE可以增加肺中PAD表達，并從而增加瓜氨酸化蛋白質［14］。此外TE和牙齦卟啉單胞菌感染等可造成攜帶SE的RA易感者初始炎癥，導致含PADl4的細胞凋亡或凋亡過程中鈣離子內流，激活PADl4催化細胞內自身抗原瓜氨酸化并外溢，從而打破耐受。

在其他方面，魚中ω-3脂肪酸有助于防止RA的發生，改善癥狀。潮濕的環境與RA的發病有關，寒冷和潮濕作為一種全身刺激因子，作用于具有某些遺傳特征的免疫系統，使其發生功能改變，從而促使RA發病。另外，寒冷和潮濕作為不良的環境因素，可能誘發或加劇某些致病因子的作用，通過自身免疫機制發生RA。此外研究顯示，初潮年齡越大，發病的危險性越大。目前認為，女性激素可能為RA發病的保護因素，表現在妊娠期RA病情的緩解及口服避孕藥的婦女RA發病率較低。初潮年齡晚也可使女性激素處于較低水平而增加RA發病的危險性，同理絕經的時間對RA的發病無影響［15］。

3　抗瓜氨酸蛋白抗體種類

2010年，ACPA被美國風濕病學會（ACR）/ 歐洲抗風濕病聯盟（EULAR）納入RA診斷標準。檢測ACPA的方法主要是通過不同瓜氨酸表位，將不同種類的瓜氨酸抗原作為底物進行檢測。抗核周因子（APF）抗體是最早發現的ACPA抗體，早在1964 年首次發現，特異性為89% ～ 94%，敏感性為50% ～ 80%。1979 年，抗角蛋白抗體（AKA）被首次發現，在此后的試驗中發現AKA的靶抗原是角質層的絲聚蛋白，此抗體特異性94% ～ 98%，敏感性40% ～ 60%。此外，還有抗聚角微絲蛋白抗體（AFA）和抗瓜氨酸化纖維蛋白原（ACF）抗體等多種抗體。日前，最為廣泛使用的是抗環瓜氨酸肽（CCP）抗體，而抗瓜氨酸波形蛋白（MCV）抗體和抗病毒瓜氨酸肽（VCP）抗體也較為常見。

3.1抗環瓜氨酸肽（CCP）抗體 2000年，國外學者成功合成人工抗原環瓜氨酸肽（CCP），并利用ELISA方法在RA患者體內檢測到抗CCP抗體，大量研究結果顯示抗CCP抗體對RA具有較高的敏感性和特異性。2002年至今最廣泛使用的ACPA為第二代CCP抗體。研究顯示，CCP2抗體的特異性達96%，敏感性72%。約50% ～ 70%的早期RA患者抗CCP2抗體陽性［16］，且表型非常穩定，治療后幾乎無患者由陽性轉為陰性。相對RF而言，CCP2抗體特異性更高，僅約1%～2%的健康人CCP2抗體陽性，僅少數的相關疾病如系統性紅斑狼瘡（SLE）［17］，混合型結締組織病（MCTD），肌炎等可能有抗CCP2抗體陽性，這些抗體陽性率約10%。而這些患者，通常也表現出類似RA的癥狀，如多發性關節炎等，或同時伴發RA。多數研究表明CCP3的檢測針對多種瓜氨酸表位抗原，在多數早期RA患者體內存在抗CCP3聯合表位的抗體，其特異性93%，敏感性74%，與CCP2相比無優勢。但在RF陰性的RA患者中，第3代CCP抗體被認為有更好的普適性［18］。

3.2抗突變型瓜氨酸波形蛋白（MCV）抗體 波形蛋白是一類存在于細胞質中的中間纖維絲蛋白，包含43個精氨酸殘基。該蛋白主要由滑膜微環境分泌，是表達在滑膜組織中的一類相關自身抗體［19］。抗MCV抗體比抗CCP抗體能更好地預測RA患者關節損傷情況。在RA和其他系統風濕性疾病的區分中，抗MCV抗體表現出更好的敏感性和特異性［20］。抗MCV抗體已經被證實是一種更為敏感的ACPA的抗原性靶點，但特異性低于抗CCP2抗體［21］，兩者聯合檢測可以將敏感性提升至85%。

3.3抗病毒瓜氨酸肽（VCP）抗體 近年來，有研究顯示一種新型病毒瓜氨酸肽（VCP）可用于輔助RA的診斷。VCP包括VCP1和VCP2，分別來自EB病毒編碼的EBNA-1蛋白和EBNA-2蛋白。抗VCP2抗體特異性95%，敏感性61%。抗CCP抗體陰性的RA患者中VCP1陽性1%，而VCP2陽性4%。反之，在VCP抗體陰性的RA患者中3%為抗CCP抗體陽性［22］。由此可見，抗VCP抗體和抗CCP抗體聯合檢測有助于ACPA抗體的檢測。

4　抗瓜氨酸抗體在RA中的作用

大量研究顯示ACPA的出現早于RA臨床發病，同時ACPA表位擴展和疾病的發展有關。在RF或SE陰性而ACPA或抗CCP抗體陽性的關節痛患者可以預測其可能會發展為關節炎［23］，在這過程中其血清內可測得的APCA表位和水平均會有明顯的提升，這顯示瓜氨酸化可能參與ACPA陽性RA的發展。研究顯示，在實驗動物模型中ACPA不僅可以誘導還可以惡化關節炎。給II型膠原誘導性關節炎小鼠模型注射瓜氨酸化纖維蛋白原單抗可以使其病情加重。但對照組中，無關節炎的動物則不會引起關節損傷。此外瓜氨酸化II型膠原或瓜氨酸化纖維蛋白原，可以誘導炎癥性關節炎實驗小鼠模型［24］。

在體外模型中，ACPA相關的免疫復合物可以通過FcγRIIa與人類巨噬細胞結合，從而促進腫瘤壞死因子的分泌。ACPA陽性的RA患者的滑膜炎損傷速度比ACPA陰性的患者更快［25］。在體外，ACPA能通過經典途徑和旁路途徑激活補體系統，證明其在病理生理方面參與RA的病程［26］。這些均證實瓜氨酸化加強局部炎癥反應和損傷。雖然具體機制尚未明確，但目前研究顯示RA發病由瓜氨酸抗原抗體介導。

目前研究表明，ACPA陽性和陰性是兩種有著明顯不同的危險因素的RA亞群，這兩個亞群可視為具有不同病理生理基礎的兩個獨立的疾病。功能學研究顯示ACPA陽性RA，能產生CCP抗體；在實驗鼠模型中，顯示CCP抗體可以誘導并且促進關節炎［27］。不同發病機制的疾病有可能會受益于不同的治療策略。由于ACPA可能與ACPA陽性RA患者病情發展密切相關，目前主要使用抗風濕藥物（DMARDs）中，有些藥物的靶點在于降低ACPA的水平。如甲氨蝶呤目前被廣泛用于治療風濕性關節炎和其他炎癥性疾病。甲氨蝶呤可以有效減緩ACPA陽性未分化關節炎患者轉變為RA，但對于ACPA陰性的患者無效［28］。不僅是甲氨蝶呤療效不同，臨床試驗顯示，在難治性RA中，利妥昔單抗在ACPA陽性患者中療效比陰性患者更好。

5　小結

ACPA是繼RF后RA診斷中的最重要標志性自身抗體，與RF相比具有更高的敏感性和特異性。ACPA與遺傳因素和環境因素共同影響有關，大量研究顯示，ACPA的出現早于RA臨床發病，其不僅是RA發病的潛在危險因子，還加速RA的惡化。因此早期檢測未分化關節炎患者體內的APCA水平，可以提前干預，延遲甚至可能阻止RA的出現。目前最常用的檢測ACPA方法為針對抗CCP2抗體的檢測，此外還有針對CCP3、MCV、VCP抗體等多種方法，雖然后者無法在敏感性和特異性兩方面優于CCP2，但聯合檢測將有助于ACPA抗體的檢出率。

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200025 上海交通大學醫學院