象皮生肌膏對大鼠肛瘺創面修復中TGF-β1表達的影響

曹 暉，賓東華，王愛華，李 逵，馬麗麗

(1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410007)

象皮生肌膏對大鼠肛瘺創面修復中TGF-β1表達的影響

曹 暉1，賓東華1，王愛華1，李 逵2，馬麗麗2

(1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410007)

目的探討象皮生肌膏對肛瘺術后創面修復的作用機制。方法將30只SD大鼠肛瘺術后創面造模，隨機分為象皮生肌膏組、濕潤燒傷膏組和凡士林組，每組10只，分別給予相應藥物創面換藥。動態觀察各組治療后創面修復情況及肉芽組織中轉化生長因子β1(TGF-β1)的表達情況。結果象皮生肌膏組第8天、第14天創面愈合率及TGF-β1表達水平均明顯高于其他2組(P均<0.05)，第14天創面愈合率濕潤燒傷膏組高于凡士林組(P<0.05)；創面水腫評分明顯低于其他2組(P均<0.05)，而濕潤燒傷膏組低于凡士林組(P<0.05)；創面完全愈合時間明顯短于其他2組(P均<0.05)，而濕潤燒傷膏組短于凡士林組(P<0.05)。結論象皮生肌膏可明顯提高肛瘺術后創面愈合率，縮短創面愈合時間，其促進肛瘺術后創面愈合的作用機制可能與調節創面中TGF-β1表達有關。

肛瘺；創面修復；TGF-β1；象皮生肌膏

肛瘺是肛門直腸瘺的簡稱。肛瘺作為一種比較常見的肛門直腸疾病，占我國占肛腸病發病人數的1.67%～3.6%，國外相對較高占8%～25%[1]。肛瘺不能自愈，必須采取手術治療，同時由于肛瘺發病部位特殊，術后創面不易保持清潔干燥，所以肛瘺切口一般不予縫合，故術后創面多、愈合緩慢、傷口疼痛、病程長[2]。因此如何加速肛瘺術后創面修復，減輕術后疼痛，提高愈合質量成為肛腸科醫師研究的重點課題之一。象皮生肌膏為湖南中醫藥大學第一附屬醫院自制藥，前期臨床觀察已證明其能明顯促進肛瘺術后創面修復，現通過動物實驗來探討其促進肛瘺術后創面愈合的作用機制。

1 實驗資料

1.1材料

1.1.1實驗動物 選用健康成熟未交配過的清潔級 Sprague-Dawley大鼠30只,雄15只,雌15只，體質量180～220g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(湘) 2013-0004。

1.1.2主要試劑與設備 象皮生肌膏(湖南中醫藥大學制劑研究室制備，湘藥制字Z20070276)，濕潤燒傷膏(汕頭市美寶制藥有限公司生產，國藥準字Z20000004)，凡士林(湖南中醫藥大學制劑研究室制備)，金黃色葡萄球菌大腸桿菌混合菌液(湖南中醫藥大學微生物實驗室提供)，生理鹽水(湖南科倫制藥有限公司生產，500mL，國藥準字H43020480)，轉化生長因子β1(TGF-β1)抗體、過氧化物酶標記二抗和ABC試劑盒(中國武漢博士德公司)，Sigma3K18型低溫冰凍離心機(美國Sigma公司)，電子天平稱Toledo(瑞士METTLER公司)，IMS細胞圖像分析系統(美國Pierce公司)。

1.2方法

1.2.1動物造模 參照付小兵等[3]及鄭雪平等[4]方法并加以改進制造肛瘺術后感染性創面的動物模型。術前對SD大鼠背部手術區域備皮，以10%水合氯醛經預試驗確定為4mL/kg劑量腹腔注射進行麻醉，麻醉成功后，在備皮區用絡合碘常規消毒，以直徑2.0cm大小的圓形標記蓋于備皮區印記進行標記，做一圓形切口，破壞皮膚全層及皮下淺筋膜直至肌層，止血后在創面上加濃度為1.0麥氏單位的金黃色葡萄球菌大腸埃?；旌暇航葸^的濕紗布，用黑色醫用絲線縫合3針進行固定，24h后去除紗布，見傷口有膿性分泌物為造模成功，使之形成一個“急性、開放、滲血、感染”的類似于臨床肛瘺術后的感染性創面。以后每次治療前0.5h在創面內滴加1.0麥氏單位大腸桿菌與金黃色葡萄球菌標準混合菌液0.1mL。

1.2.2分組及給藥 將造模后的30只SD大鼠隨機分為象皮生肌膏組、濕潤燒傷膏組和凡士林組，每組10只。象皮生肌膏組傷口用絡合碘常規消毒后，生理鹽水沖洗，用等面積的象皮生肌膏紗條完全覆蓋創面，其上再蓋無菌紗布并固定。濕潤燒傷膏組傷口用絡合碘常規消毒后，給予生理鹽水沖洗，用等面積的濕潤燒傷膏紗條完全覆蓋創面，再蓋無菌紗布并固定。凡士林組傷口消毒沖洗后覆蓋凡士林紗條，再蓋無菌紗布并固定。3組均每天換藥2次，連續用藥14d。

1.3觀察指標及方法

1.3.1創面愈合率 每天觀察創面愈合情況，于治療后第8，14天采用透明膠片描記測定局部創面面積，評價記錄各組創面動態愈合率。創面愈合百分率(%)=(同組d0創面面積-同組dn創面面積)/同組d0創面面積×100%(n為治療干預后的測量時間)。

1.3.2創面愈合時間 記錄每組大鼠創面完全愈合(即完全上皮化)時間。

1.3.3創面水腫情況 記錄治療后第5,8,14天創面消腫情況，無水腫為0分；創面輕度水腫為1分；創面水腫明顯，換藥后緩解為2分；創面水腫重，需手術切除為3分。

1.3.4免疫組化檢查 分別于治療后第8,14天在無菌條件下用眼科剪剪取創緣新鮮肉芽組織，生理鹽水清洗，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，無菌紗布沾干。應用免疫組化S-P法檢測肉芽組織中TGF-β1表達水平(具體實驗方法按照試劑盒說明書逐步操作)。

2 結 果

2.13組創面愈合率及完全愈合時間比較 治療后第8，14天，象皮生肌膏組創面愈合率明顯高于濕潤燒傷膏組和凡士林組(P均<0.05)，治療后第14天3組創面愈合率均明顯高于第8天(P均<0.05)，且濕潤燒傷膏組高于凡士林組(P<0.05)；創面完全愈合時間象皮生肌膏明顯短于濕潤燒傷膏組和凡士林組(P均<0.05)，濕潤燒傷膏組短于凡士林組(P<0.05)。見表1。

表1 3組創面愈合率及愈合時間比較

注：①與治療第8天比較，P<0.05；②與象皮生肌膏組比較，P<0.05；③與濕潤燒傷膏組比較，P<0.05。

2.23組創面水腫情況比較 治療后第5天，3組創面水腫評分比較差異無統計學意義(P均>0.05)。治療后第8，14天，3組創面水腫評分均明顯低于治療后第5天(P均<0.05)，且治療后第14天低于治療后第8天(P均<0.05)；象皮生肌膏組水腫評分明顯低于濕潤燒傷膏組和凡士林組(P均<0.05)，濕潤燒傷膏組低于凡士林組(P<0.05)。見表2。

表2 3組創面水腫情況比較分)

注：①與治療后第5天比較，P<0.05；②與治療后第8天比較，P<0.05；③與象皮生肌膏組比較，P<0.05；④與濕潤燒傷膏組比較，P<0.05。

2.33組創面肉芽組織中TGF-β1表達情況比較 治療后第8，14天，象皮生肌膏組TGF-β1表達明顯高于濕潤燒傷膏組和凡士林組(P均<0.05)，且各組治療后第8天水平均高于治療后第14天(P均<0.05)。見表3。

表3 3組創面肉芽組織中TGF-β1表達情況比較

注：①與象皮生肌膏組比較，P<0.05；②與治療后第14天比較，P<0.05。

3 討 論

肛瘺是肛管或直腸與肛門外皮膚相通的一種異常管道，一般由內口、瘺管、外口組成，主要表現為肛周流膿、疼痛、瘙癢和排便不暢等。肛瘺一般不能自愈，必須采取手術治療，然而因肛門的特殊生理功能，每天會受到排便造成的機械性損傷和糞便污染，使肛瘺術后創面的愈合緩慢，病程長達1個月至數月，給廣大的肛瘺患者造成了極大痛苦。因此如何促進肛瘺術后創面的愈合成了近年肛腸科醫師重點關注的問題。

中醫學將促進膿腐傷口愈合的作用分為清熱解毒、祛腐提膿、生肌收口3個步驟[5]。中醫生肌法是中醫外科臨床治療大法之一，常用于“腐肉已脫，新肉不生”的各種急慢性創面，對于該療法的理論論述和臨床方藥記載在歷代中醫古籍中都有豐富的論述。由于目前手術清創在現代醫學的臨床應用已經非常廣泛和完善，肛瘺創面腐爛組織在術中已經被全部清除，因此在術后創面修復中生肌藥物療法才是中醫的特色和優勢。特別對于術后創面，如何更好、更快地生肌是需要解決的重點問題。

象皮生肌膏是湖南中醫藥大學第一附屬醫院中醫外科在整理中醫古代文獻結合現代臨床實踐基礎上總結出的行之有效的外科常用換藥方，出自張山雷《瘍科綱要》，并在其原方基礎上對其藥物及藥量配伍稍加化裁，同時在制膏工藝上加以改進制成，藥物組成主要包括象皮、當歸、地黃、血余炭、爐甘石、石膏等。此膏藥的主要藥物象皮具有止血、斂瘡的功效；當歸補血活血、消腫止痛、排膿生?。坏攸S具有清熱、生津滋陰、涼血之功效；血余炭有消瘀、止血之功；爐甘石有解毒明目退翳、收濕止癢斂瘡之功；石膏清熱解毒、瀉火。諸藥合用具有清熱活血、散瘀止痛、斂瘡生肌的作用，針對腐肉已凈、新肉未生的主要病理環節，充分調節體內陰陽氣血，調其氣化，最終達到生肌長肉的目的。該制劑藥物性狀穩定，外科臨床用之于創面換藥，生肌效果明顯，能夠縮短肛瘺患者術后創面愈合時間，減輕患者術后疼痛。

現代醫學認為，創面修復過程存在一個極其復雜的信號網絡調控機制，涉及組織、細胞、分子、基因等多個層面，任何一個環節的失控將會導致自身調節的失控。各種生長因子參與了傷口愈合的調控，在組織修復中有決定意義。其中TGF-β1屬于TGF-β細胞因子超家族，是目前公認的與創傷愈合關系密切的細胞因子之一[6]，其主要作用是趨化成纖維細胞和炎癥細胞向傷口聚集，誘導肉芽組織生長和表皮形成，是一類對創面修復有重要調控作用的多功能的細胞因子[7-9]。

本實驗通過建立大鼠肛瘺術后創面模型，發現象皮生肌膏組治療后第8，14天創面愈合率及創面完全愈合時間均優于濕潤燒傷膏及凡士林組，創面水腫評分明顯低于濕潤燒傷膏組及凡士林組，而濕潤燒傷膏組低于凡士林組。治療后第8天，14天象皮生肌膏組TGF-β1的表達水平高于濕潤燒傷膏組及凡士林組。治療組第8天的TGF-β1表達水平高于第14天。表明象皮生肌膏在修復早期可能通過提高TGF-β1表達水平來加速創面愈合。

本實驗結果提示生肌法代表藥物象皮生肌膏能促進肛瘺術后創面愈合，縮短愈合時間，改善傷口水腫情況，能影響TGF-β1因子在創面中表達，可能是通過調控TGF-β1/Smad3信號通路來實現的，這也為臨床推廣應用此藥提供了實驗依據。然而創面愈合是一個多因素網格化相互作用的過程，故其更具體全面的作用機制還需更進一步的研究。

[1] 林毅,蔡炳琴.外科專病中醫臨床診治[M].2版.北京:人民衛生出版社，2000:434-468

[2] 蔡而瑋，徐照秀，陳民藩.紫白膏促進肛瘺術后創面愈合臨床研究[J].實用中醫藥雜志，2005，21(3)：160

[3] 付小兵,孫同柱,盛志勇.幾種用于創傷修復研究的動物模型[J].中華實驗外科雜志,1999,16(5):479

[4] 鄭雪平,許慧琴,丁義江,等.復方珠黃霜對兔背部人糞污染創面愈合的實驗研究[J].中國中西醫結合外科雜志,2002,8(5):361

[5] 馬紅鋒，段義林.創愈膏在肛瘺術后的臨床療效觀察[J].中國民族民間醫藥雜志，2004，69(4)：216-217

[6] Rhett JM,Ghatnekar,GS,Palatinus JA,et al.Novel therapies for scar.reduction and regenerative healing of skin wounds[J].Trends Biotechnol,2008,4(26):73

[7] Brunner G,Blakytny R.Extracellular regulation of TGF-bete activity in wound repair:growth factor latency as a sensor mechanism for injury[J].Thromb Haemost,2004,92(2):253-261

[8] 邱林，金先慶.轉化生長因子β在創傷愈合、疤痕增生以及骨形成方面的研究與進展[J].中國臨床康復，2005,9(10)：178-179

[9] 付小兵.慢性難愈合創面防治理論與實踐[M].北京：人民衛生出版社，2011:135

Effect of Xiangpi Shengji ointment on the expression of TGF-β1in the wound repair of anal fistula of rats

CAO Hui1, BIN Donghua1, WANG Aihua1, LI Kui2, MA Lili2

(1.First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan, China; 2.Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, Hunan, China)

Objective It is to discusses the mechanism of Xiangpi ShengJi ointment in the wound repair of anal fistula.Methods 30SD rats were selected to establish the models of postoperative wound of anal fistula, then they were randomly divided into 3groups, respectively as Xiangpi ShengJi ointment group, moist burn cream group and vaseline group, each group had 10rats and were given respective drugs for dressing changes.The wound repair and the expression of TGF-β1in granulation tissue in every group were observed.Results The curing rate of wound and the expression rate of TGF-β1in Xiangpi ShengJi ointment group on the 8th and 14th day were significantly higher, while wound edema scores were lower, wound healing time was shorter than those in the other two groups (P<0.05), and on the 14th day, the indexes above including curing rate of curing rate, wound edema scores, wound healing time in moist burn cream group were better than that in vaseline group.Conclusion Xiangpi ShengJi ointment could obviously increase wound healing rate after anal fistula surgery, shorten wound healing time, and this mechanism may related with its regulation of the expression of TGF-β1in wound tissue.

anal fistula; wound repair; TGF-β1; Xiangpi ShengJi ointment

曹暉，男，副主任醫師，副教授，碩士生導師，從事肛腸病研究工作。

湖南省中醫藥科研計劃項目(201364)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.19.004

R-332

A

1008-8849(2015)19-2065-03

2015-01-30