18β?甘草次酸對變應性鼻炎大鼠鼻黏膜中水通道蛋白1和5表達的影響

黎橋，席克虎，桂巖，王有虎，張福宏，陳小婉，江英，侯赟，張小兵

（蘭州大學附屬第一醫院耳鼻咽喉頭頸外科，蘭州 730000）

·論著·

18β?甘草次酸對變應性鼻炎大鼠鼻黏膜中水通道蛋白1和5表達的影響

黎橋，席克虎，桂巖，王有虎，張福宏，陳小婉，江英，侯赟，張小兵

（蘭州大學附屬第一醫院耳鼻咽喉頭頸外科，蘭州 730000）

目的 觀察18β-甘草次酸對變應性鼻炎大鼠鼻黏膜水通道蛋白（AQP）表達的影響并探討其意義。方法將60只Wistar大鼠隨機均分為18β-甘草次酸組、氯雷他定組、模型組和正常對照組，18β-甘草次酸組、氯雷他定組及模型組大鼠經卵清蛋白（OVA）致敏建立變應性鼻炎疾病模型，造模成功后分別給藥干預，于給藥2、4、6、8、10周時，應用免疫組織化學方法（SP法）檢測各組鼻黏膜中AQP1和AQP5的表達并進行比較。結果AQP1和AQP5在各組大鼠鼻黏膜中分布相同，AQP1主要表達于上毛細血管、血竇內皮細胞及成纖維細胞。AQP5強表達于腺上皮、導管上皮及黏膜上皮細胞的胞膜及胞質。免疫組化染色統計學分析顯示，AQP1和AQP5在模型組的表達量顯著高于正常對照組（P＜0.05），在18β-甘草次酸組及氯雷他定組大鼠鼻黏膜中的表達量均隨給藥干預的時間延長逐漸下降，并接近于正常對照組。結論18β-甘草次酸可能通過下調AQP1和AQP5的表達緩解變應性鼻炎撓鼻、噴嚏及流涕等癥狀。

18β-甘草次酸；水通道蛋白1；水通道蛋白5；變應性鼻炎；免疫組織化學

甘草次酸（C30H46O4）是甘草在體內經β-葡萄糖醛酸酶代謝后產生的主要有效成分，屬于五環三萜烯類化合物，可分為18β-甘草次酸（18β-glycyrrhetinic acid，18β-GA）及18α-甘草次酸2種光學異構體。自然界18α-甘草次酸含量極少，目前的研究主要以18β-GA為主。研究表明，18β-GA具有抗炎［1］、抗腫瘤［2］、抗病毒［3］、抗過敏［4］等多種藥理作用。變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是IgE介導的Ⅰ型超敏反應，以黏膜水腫、毛細血管擴張及腺體增生為基本病理改變，臨床癥狀主要表現為鼻塞、鼻癢及大量清涕，影響著全球10%～20%人的生活質量和健康。水通道蛋白（aquaporin，AQP）是一類參與水跨膜轉運的特異性通道蛋白，與細胞內外液體的轉運及腺體的分泌密切相關。已有研究證明AQP廣泛分布于鼻黏膜組織，且在組織的水轉運和代謝異常過程中發揮重要作用［5］。18β-GA能通過調節免疫功能干預AR［6］，但其對AR鼻黏膜組織中AQP的影響鮮有報道。因此，本研究擬觀察18β-GA治療AR過程中對AQP1、AQP5的影響，探討18β-GA的干預作用與AQP的相關性。

1 材料與方法

1.1 試劑

卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（美國Sigma公司，批號：1001445093），18β-GA（甘肅泛植生物科技有限公司，批號：12081603），氯雷他定（四川奧邦藥業有限公司，批號：121109）。兔抗大鼠AQP5購自英國Abcam公司，兔抗大鼠AQP1購自美國Sigma公司，兔SP檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及維持：無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級Wistar大鼠60只（甘肅中醫學院SPF動物實驗室提供），4～6周齡，體質量180～220 g。采用隨機數字表法將60只大鼠隨機分成18β-GA組（n=15）、氯雷他定組（L組，n=15）、模型組（MC組，n=15）和正常對照組（NC組，n=15）。18β-GA組、L組及MC組大鼠經OVA造模：首先基礎致敏，給予大鼠腹腔注射1 mL抗原佐劑混懸液［含0.3 mg OVA、30 mg AL（OH）3］進行致敏，隔日1次，共7次，14 d。然后鼻腔激發，在末次腹腔注射基礎致敏后隔1日開始，用2%OVA溶液對實驗組大鼠雙側鼻孔滴鼻，50 μL/側，1次/d，共7 d。每次鼻腔激發后即刻至30 min內，觀察并記錄大鼠搔鼻動作次數、噴嚏個數及流涕情況，進行癥狀學評分。NC組大鼠：以生理鹽水代替OVA，其余方法和步驟與實驗組相同。造模成功后，為了維持動物模型，18β-GA組、L組及MC組大鼠繼續給予2%OVA滴鼻，50 μL/側，2次/周，NC組大鼠以等量生理鹽水替代。1.2.2 大鼠行為學評分標準：每次鼻腔激發后即刻至30 min內觀察并記錄大鼠鼻癢程度、噴嚏次數及流涕情況。疊加量化計分法記錄各組大鼠癥狀評分值，鼻癢程度：輕度撓鼻1～2次，記1分；抓撓鼻、面不止，到處摩擦記2分。噴嚏：1～3個為1分，4～10個為2分，11個以上為3分。流涕：流至前鼻孔為1分，超過前鼻孔為2分，流涕滿面為3分。各癥狀記分疊加，總分數≥5分者為造模成功。

1.2.3 給藥方法：造模完成后，根據動物體表面積轉換計算公式，參考臨床氯雷他定膠囊及復方甘草酸苷片（日本米諾發源制藥株式會社，每片含甘草酸苷25 mg）用藥量進行換算：L組大鼠給予氯雷他定（0.96 mg/kg溶于2 mL生理鹽水）灌胃，18β-GA組給予18β-GA（21.6 mg/kg溶于2 mL生理鹽水）灌胃，NC組和MC組以等量生理鹽水替代，1次/d。分別于給藥干預2、4、6、8、10周的末次給藥24 h后，隨機挑選每組3只大鼠，共計60只大鼠，給予10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，迅速取雙側鼻中隔黏膜，放入4℃的4%多聚甲醛溶液中固定，無水乙醇梯度脫水，石蠟包埋，4.5 μm厚連續切片。

1.2.4 免疫組化染色：采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（streptavidin-perosidase，SP）法，切片經常規脫蠟、水化后，3%過氧化氫孵育15 min，PBS清洗3次，每次5 min。高壓抗原修復10 s。滴加山羊血清封閉液，室溫15 min，傾去直接滴加一抗AQP1多克隆抗體（1∶500）或AQP5多克隆抗體（1∶500），4℃，20 h。PBS清洗3次，每次5 min。加入生物素標記二抗，室溫下孵育15 min，PBS清洗3次，每次5 min。加辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液，孵育15 min，3，3′-二氨基聯苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復染、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.3 統計學處理

選擇背景清晰、染色清晰的切片做統計學分析，每只動物選取2個高倍視野。采用Image-Pro Plus 6.0軟件測量大鼠鼻黏膜AQP1、AQP5表達的平均光密度值，所有數據均用表示。應用SPSS統計學軟件進行處理，行單因素方差分析，比較兩兩差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠AR模型的建立

18β-GA組、L組及MC組大鼠（n=45）在末次鼻腔激發后均出現明顯外鼻紅腫、反復搔鼻、噴嚏不止及不同程度流涕，疊加評分均超過5分，說明AR模型造模成功。NC組大鼠僅有輕微的搔鼻、打噴嚏。MC組動物至實驗完成時每日評分均＞5分；隨給藥時間延長，18β-GA組和L組外鼻紅脹程度逐漸減輕，噴嚏次數、搔鼻次數和鼻涕逐漸減少。

2.2 免疫組化染色定位、表達情況

光鏡下鼻黏膜組織中AQP1或5陽性表達呈棕黃色或棕褐色，陰性對照不著色。MC組、NC組、L組、18β-GA組大鼠鼻黏膜中AQP1、AQP5分布一致，AQP1表達于鼻黏膜上皮下結締組織、毛細血管及血竇內皮細胞，AQP5分布于鼻黏膜上皮細胞、腺上皮及導管上皮細胞的胞膜和胞質。見圖1。

圖1 各組鼻黏膜AQP1和AQP5的陽性表達 SP法×400Fig.1 Positive expression of AQP1，5 in the nasal mucosa of each group SP×400

AQP1的表達情況如表1所示。MC組：2、4、6、8、10周時，AQP1平均光密度值均明顯高于NC組（P＜0.05）。18β-GA組：2、4周時，AQP1平均光密度值略低于MC組，但仍高于NC組（P＜0.05）；6、8、10周時，該值持續下降，均顯著低于MC組（P＜0.05），接近于NC組。L組：2周時，AQP1的平均光密度值較MC組略低，但高于NC組（P＜0.05）；4、6、8、10周時，該值進行性下降，明顯低于MC組（P＜0.05），與NC組無顯著差異。L組與18β-GA組各時間點AQP1平均光密度值比較，差異均無統計學意義。此外，18β-GA組及L組中AQP1的平均光密度值在第6、8、10周時與第2周時比較有統計學差異（P＜0.05）。

表1 各組大鼠鼻黏膜AQP1表達的平均光密度值Tab.1 The mean optical density value of AQP1 expression in the nasal mucosa of each group

表1 各組大鼠鼻黏膜AQP1表達的平均光密度值Tab.1 The mean optical density value of AQP1 expression in the nasal mucosa of each group

1）P＜0.05 vs MC group；2）P＜0.05 vs NC group；3）P＜0.05 vs 2 weeks in the same group.

Week NC group MC group 18β-GA group L group 2 0.319 2±0.038 21） 0.444 2±0.029 9 0.413 6±0.043 82） 0.409 6±0.010 72）4 0.323 2±0.017 11） 0.452 9±0.030 3 0.393 9±0.050 72） 0.340 0±0.042 61）6 0.320 4±0.027 51） 0.457 1±0.015 5 0.365 7±0.039 21），3） 0.332 4±0.024 71），3）8 0.319 1±0.032 41） 0.461 5±0.018 9 0.339 8±0.447 41），3） 0.323 5±0.037 91），3）10 0.319 8±0.025 61） 0.459 8±0.029 5 0.330 2±0.013 81），3） 0.320 1±0.013 81），3）

AQP5的表達情況如表2所示：MC組的AQP5平均光密度值在各時間點均較NC組升高（P＜0.05）。18β-GA組：2、4周時，AQP5平均光密度值較MC組顯著下降（P＜0.05），但仍高于NC組（P＜0.05）；6、8、10周時，該值進一步下降，顯著低于MC組（P＜0.05），并接近于NC組。L組：2周時，AQP5的平均光密度值略低于MC組，但高于NC組（P＜0.05）；4、 6、8、10周時，該值不斷下降，明顯低于MC組（P＜0.05），并接近于NC組。各時間點L組與18β-GA組AQP1平均光密度值比較，差異無統計學意義。此外，18β-GA組AQP5的值在第10周時較第2周時明顯降低（P＜0.05），L組中AQP5值在第8、10周時較第2周時顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠鼻黏膜AQP5表達的平均光密度值Tab.2 The mean optical density value of AQP5 expression in the nasal mucosa of each group

表2 各組大鼠鼻黏膜AQP5表達的平均光密度值Tab.2 The mean optical density value of AQP5 expression in the nasal mucosa of each group

1）P＜0.05 vs MC group；2）P＜0.05 vs NC group；3）P＜0.05 vs 2 weeks in the same group.

Week NC group MC group 18β-GA group L group 2 0.483±0.0251） 0.590±0.022 0.581±0.0241），2） 0.546±0.0021）4 0.493±0.0201） 0.610±0.015 0.539±0.0351），2） 0.537±0.0091）6 0.500±0.0171） 0.586±0.025 0.532±0.0181），2） 0.524±0.0301）8 0.488±0.0301） 0.600±0.012 0.522±0.0131） 0.511±0.0051），3）10 0.494±0.0211） 0.592±0.019 0.515±0.0191），3） 0.511±0.0031），3）

3 討論

迄今為止，哺乳動物組織中至少發現了13種AQP，即AQP0～AQP12。AQP分布于人類機體所有的內皮屏障組織及部分上皮屏障組織，與機體中液體的平衡及分泌緊密相關［7］，還可通過跨膜轉運一氧化氮調節血管舒張功能［8］。研究發現，喉癌及鼻息肉組織中AQP1表達升高且與血管內皮生長因子水平呈顯著正相關［9，10］，而在缺乏AQP1的小鼠胸腔中滲透力明顯下降［11］，提示AQP1參與毛細血管的增生并提高其通透性。本研究中，通過免疫組化檢測觀察到AQP1在MC組呈更高水平表達，在干預第2、4、6、8及10周，AR組大鼠鼻黏膜AQP1表達水平均明顯高于NC組。而AQP1在變應性鼻炎大鼠毛細血管內皮和血竇內皮細胞的表達增強，提示其可能參與促進毛細血管擴張、提高毛細血管通透性、導致炎性細胞和液體滲出而引起局部炎性反應及黏膜水腫；同時，AQP1在纖毛上皮細胞及基底細胞無表達，黏膜下滲出液轉運顯著受抑，使液體聚集于組織間隙而進一步加重黏膜水腫。

在人體中，AQP5主要表達于肺泡上皮細胞、唾液腺、腮腺、汗腺上皮細胞上，對于這些組織和器官內的水平衡起重要作用。Ma等［12］發現AQP5基因敲除后，小鼠胸膜、唾液腺及腮腺分泌液明顯減少。本研究采用免疫組織化學染色法觀察到在各觀測時間點，MC組AQP5表達水平均顯著高于NC組，提示腺上皮、導管上皮內高度表達的AQP5可能參與促進黏膜下漿液性腺、黏液腺增生及分泌，從而導致MC組大鼠出現大量清涕等表現。

氯雷他定是臨床治療變應性鼻炎的一線藥物，屬于長效2代抗組胺藥，競爭性地抑制組胺H1受體，抑制組胺所引起的過敏癥狀。在臨床治療中，效果良好，相比1代抗組胺藥物，該藥無明顯的抗膽堿和中樞抑制作用。長期服用該藥可能出現頭痛、嗜睡、口干、視覺模糊、心悸、暈厥、運動機能亢進、黃疸、肝炎、肝壞死、脫發、癲癇發作、乳房腫大、多形性紅斑及全身性過敏反應等不良反應。本研究中，氯雷他定具有改善大鼠變應性鼻炎的癥狀，下調變應性鼻炎大鼠鼻黏膜AQP1和AQP5表達的作用。而18β-GA對大鼠鼻黏膜癥狀改善及AQP1和AQP5的調節作用與氯雷他定無明顯差別，故認為在變應性疾病中，18β-GA可達到和氯雷他定相同的干預效果，均能通過下調變應性鼻炎大鼠鼻黏膜中AQP1和AQP5的表達，改善AR癥狀。但18β-GA的不良反應還需進一步研究。

甘草次酸又稱甘草亭酸，分子式為C30H46O4，其骨架11位上有C=O，類似18-H-齊墩果烷型結構。因GA的分子構像與類固醇激素相似，其物理特性、生物活性與類固醇激素也相類似，故其可作為配體與類固醇激素競爭性結合甾體激素的受體，還可與其代謝酶結合，從而產生多種多樣的生物學功效。甘草次酸通過下調11β-HSD活性從而阻止類固醇激素的失活代謝，使內源性和外源性類固醇激素的血液濃度升高和半衰期延長［13］。甘草次酸在兔肝胞漿中與類固醇受體結合的抑制常數達1.7 nmol/L，即甘草次酸可以與類固醇激素受體相匹配，對激素引起下丘腦-垂體-腎上腺-受體系統抑制有拮抗作用，從而一定程度減少和減輕激素的某些副作用以及不良反應［14］。單用甘草次酸時可出現輕度的激素樣作用，而與糖皮質激素合用時，可有效提高激素的抗過敏反應、抗炎和抗應激反應等效果，從而制造直接或間接的糖皮質激素樣作用。暗示甘草次酸可能通過其糖皮質激素樣作用干預AR疾病。

已有研究發現，18β-GA應用于哮喘治療時，能顯著下調血清IgE、白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）、白細胞介素5（interleukin-5，IL-5）水平，抑制γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和IgG的降低，從而糾正Th1/Th2失衡［15］。Kroes等［16］認為甘草次酸通過抑制補體經典途徑而發揮抗炎作用，但對其旁路激活途徑無影響。本研究中，AR大鼠經18β-GA干預后，外鼻紅脹程度逐漸減輕，噴嚏次數、搔鼻次數和鼻涕逐漸減少，鼻黏膜中AQP1和AQP5表達水平低于MC組，且隨干預時間的延長而逐漸下降并接近NC組。因此，推測18β-GA通過下調變應性鼻炎大鼠鼻黏膜中AQP1和AQP5的表達，減輕液體在組織間的潴留，抑制炎性細胞滲出及腺體分泌，改善AR癥狀。

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（編輯 王又冬）

Effect of18β-glycyrrhetinic Acid on Aquaporin 1，5 Expression in the Nasal Mucosa of Rats with Allergic Rhinitis

LIQiao，XIKe-hu，GUIYan，WANGYou-hu，ZHANG Fu-hong，CHENXiao-wan，JIANGYing，HOUYun，ZHANGXiao-bing

（Department of Ear-Nose-Throat，The First Hospital Associated to the Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

Objective To investigate the influence and its significance of 18β-glycyrrhetinic acid on the expression of aquaqporin 1，5（AQP1，5）in rat nasal mucosa with allergic rhinitis（AR）.MethodsSixty Wistar rats were randomly divided into four groups：model control group，loratadine group，18β-glycyrrhetinic acid group and normal control group.Rats in model control group，loratadine group and 18β-glycyrrhetinic acid group were first induced for allergic rhinitis by dripping ovalbumin，and then were treated respectively.After 2 weeks，4 weeks，6 weeks，8 weeks and 10 weeks，the expression of AQP1，5 in the nasal mucosa of each group was investigated and compared by immunohisto chemical technique.ResultsThe distribution of AQP1，5 was consistentin allgroups.AQP lexpressed mainly in capillary and blood sinus endothelial cells，and fibrocytes.AQP5 expressed intensively in the membrane and cytoplasm of the epithelium in the glands，cilia，and ductal epithelial area.The statistical analysis of immunohistochemical staining showed that the quantity of AQP1，5 in model group was significantly higher than that in normal group（P＜0.05），and with the extension of drug intervention time，the expression of AQP1，5 in loratadine group and 18β-glycyrrhetinic acid group were gradually decreased and almost equivalent to normal group.Conclusion18β-glycyrrhetinic may relieve symptoms of AR by down-regulating the expression of AQP1，5.

18-βglycyrrhetinic acid；aquaporin 1；aquaporin 5；allergic rhinitis；immunohistochemistry

R765.21

A

0258-4646（2015）11-0961-05

國家自然科學基金（81160449）；甘肅省衛生廳行業科技計劃（GSWST2011-06）；甘肅省中醫藥科學技術研究課題（GZK-2011-22））

黎橋（1989-），女，碩士研究生.

張小兵，E-mail：790736924@qq.com

2014-12-29

網絡出版時間：