改良溴化乙錠染色法快速檢測基因組DNA

田秀榮，郭麗，高兵，劉健

（沈陽醫學院1.細胞生物學與遺傳學教研室；2.科學實驗中心，沈陽 110034）

改良溴化乙錠染色法快速檢測基因組DNA

田秀榮1，郭麗2，高兵1，劉健1

（沈陽醫學院1.細胞生物學與遺傳學教研室；2.科學實驗中心，沈陽 110034）

目的探討一種耗時少、檢出率高的基因組DNA檢測方法。方法采用改良的溴化乙錠染色法檢測提取到的樣本基因組DNA。采用分光光度儀進行敏感性驗證，聚合酶鏈式反應確認該方法能否用來檢測PCR產物。結果改良的溴化乙錠染色法顯著減少基因組DNA的上樣量，提高基因組DNA的檢測敏感性，節省操作時間，無需loading buffer，并可粗略估計基因組DNA濃度。結論改良的溴化乙錠染色法只適用于初篩樣本基因組DNA，不能用于評估DNA片段的長度。

瓊脂糖凝膠電泳法；基因組DNA；溴化乙錠

基因組DNA提取被廣泛應用于醫學、生命科學的許多領域［1］。2003年人類基因組計劃的完成，為人類利用基因組DNA遺傳密碼破解疾病機制奠定了基礎［2］。成百上千例樣本的病例-對照研究越來越多的被用于篩選疾病相關候選基因及其變異位點和在基因水平闡明疾病的發病機制。這些研究中需要先期進行大規模的樣本基因組DNA提取和檢測工作。

長期以來，基因組DNA提取后的檢測是通過瓊脂糖凝膠電泳/溴化乙錠染色法進行觀察［3～5］。這種方法在基因組DNA樣本檢測的時候，需要樣本DNA的上樣量較大。在微量DNA上樣時或提取的基因組DNA含量低時，敏感性差，不易觀察到陽性結果。此外，瓊脂糖凝膠電泳檢測法用于檢測大批量樣本基因組DNA時，顯得有些費時、費材、費力。

考慮到瓊脂糖凝膠電泳/溴化乙錠染色的這些缺點，本研究介紹了一種改良的溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色法（以下簡稱“改良法”），該方法可以快速初篩樣本基因組DNA。

1 材料與方法

1.1 樣本及基因組DNA提取

本研究經沈陽醫學院學術委員會同意，遵守知情同意原則，從沈陽市第四人民醫院門診采集161例正常人末梢靜脈血液樣本。血液經EDTA抗凝后，保存于-20℃冰箱。采用Blood Genome DNA Extraction試劑盒（D9081，TaKaRa公司）提取樣本的全血基因組DNA，所有操作按照試劑盒提供的操作流程進行。取100 μL全血，加入GenTLE Solution 1破壞血細胞，同時與核酸形成電中性的復合體，Gen-TLE Solution 2清洗，GenTLE Solution 3分離基因組DNA，用異丙醇回收DNA沉淀。

1.2 改良的溴化乙錠染色檢測基因組DNA

剪切適當大小的PARAFILM?“M”封口膜，按照檢測樣本數在封口膜上間隔適當間距均勻點樣2 μL 0.5 μg/mL EB，分別吸取2 μL待檢DNA樣本與封口膜上EB充分混合，室溫下靜置2～3 min，將封口膜置于暗箱式雙光紫外儀下觀察實驗結果。DNA與EB混合呈棕黃色斑點，無DNA的斑點呈無色透明。

1.3 敏感性驗證

提取的樣本基因組DNA用分光光度儀進行濃度檢測，用CDNA表示DNA濃度，DNA純度Ratio值為A260/A280比值。取5 μL樣本基因組DNA依次進行2×、4×、8×、16×和32×的倍比稀釋。用改良法和傳統的凝膠電泳檢測法依次進行檢測，改良法基因組點樣量為2 μL，凝膠電泳法每孔上樣量為5 μL。瓊脂糖凝膠電泳法實驗步驟概括如下，配制1%瓊脂糖凝膠塊（含0.5 μg/mL EB），將5 μL基因組DNA與1 μL 6×loading buffer充分混合后上樣。100 V電泳30 min，暗箱式雙光紫外儀下觀察實驗結果。

1.4 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）

為確認改良的EB染色法能否用來檢測PCR產物，隨機選取10例DNA樣本進行PCR擴增反應。應用TaKaRa Taq酶（DR001A，TaKaRa公司），擴增β -actin基因片段，正向引物為5′-TCGTGCGTGACATT AAGGAG-3′；反向引物為5′-AGCACTGTGTTGGC GTACAG-3′，產物為369 bp。反應條件：96℃，1 min；30個循環的94℃30 s，60℃30 s和72℃60 s；72℃2 min。反應體系為25 μL。PCR反應產物分別與單獨加入的dNTP組、DNA模板組、引物組進行比較。

1.5 統計學方法

應用SPSS 10.0統計軟件包，瓊脂糖凝膠電泳/ EB染色法和改良EB染色法的DNA檢出率的比較采用配對χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 改良EB染色法檢測基因組DNA

經分光光度儀檢測待測DNA的A260為0.19，CDNA為7.06 ng/μL，Ratio為1.865。在紫外儀下EB與基因組DNA按1∶1混合后與單一DNA組、EB組及滅菌蒸餾水組比較，其熒光強度明顯增強，肉眼即可清晰分辨，見圖1。

圖1 改良法檢測基因組DNAFig.1 An improved method to detect genomic DNA

2.2 檢測敏感性比較

通過倍比稀釋，比較2種基因組檢測方法的檢測敏感度。結果顯示，凝膠電泳法在基因組DNA在經8倍稀釋后就幾乎看不到熒光，而改良法在基因組原液稀釋16倍后仍可觀察到較明顯的熒光，見圖2。

圖2 改良法和電泳法檢測稀釋的基因組DNA結果Fig.2 Comparison of the results from the improved method and electrophoresis method for the dilution of genome DNA detection

2.3 改良EB染色法和凝膠電泳法檢測樣本基因組DNA

進一步通過2種檢測法檢測161例新提出樣本的基因組DNA，改良法共檢出106個樣本，傳統的瓊脂糖凝膠電泳法檢出65個樣本（表1，圖3）。結果表明改良法的樣本檢出率明顯高于凝膠電泳法（P＜0.001），說明2種方法在檢出敏感性上具有顯著的差異。

用傳統的瓊脂糖凝膠電泳法檢測基因組，一般的制膠板制作的膠要少于20孔，1次電泳檢測的樣本數要低于20個，而改良法1次可檢測50個樣本。分別用這2種方法檢測同一基因組DNA。結果顯示：改良法與傳統凝膠電泳法檢測DNA，2種方法的差異有統計學意義，見圖3。

2.3 操作時間比較

凝膠電泳法檢測分為配膠、制膠、上樣、電泳、觀察幾個步驟，配膠制膠用時需1 h，上樣時間與樣本數有關，每個樣本的平均上樣時間約1 min，電泳30 min，總用時約90 min。改良法直接將基因組DNA與EB混合，無需將基因組DNA與loading buffer混合，僅需要點樣時間即可。因此要檢測同樣數量的樣本，改良法比凝膠電泳法要少用時90 min。

表1 改良法和電泳法檢測161例樣本基因組DNA結果Tab.1 Detection of 161 cases of genomic DNA samples using improved method and electrophoretic method

圖3 改良法和電泳法檢測基因組DNA檢測結果對照Fig.3 Comparison of genome DNA detection by improved method and electrophoretic method

2.4 PCR產物檢測

10例DNA樣本的β-actin基因片段被擴增，用“改良法”進行檢測，與單獨加入dNTP組、DNA模板組、引物組進行比較發現，斑點均呈現棕黃色。

3 討論

研究疾病的發生與致病基因及其相關變異并在此基礎上闡明疾病的機制一直是研究人員努力的方向。目前，包括癌癥、心血管疾病、精神疾病、高血壓和糖尿病在內的各種復雜疾病的基因組學研究都全面展開［6～8］。在這些研究中均需要進行大樣本基因組DNA的基礎提取和檢測工作。本研究首次介紹了一種高敏感度的快速檢測基因組DNA的方法。該方法在DNA的上樣量、敏感性、檢測時間和使用材料上都具有顯著的優點。

基因組DNA的提取受樣本條件、提取方法和操作技術的影響，經常會出現提取失敗或只提取了少量DNA的情況，因此需要對提取后的DNA進行檢測，以確保下一步實驗的順利進行。目前廣泛使用的是傳統的瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度儀法。瓊脂糖凝膠電泳法在檢測大批量樣本時，因需要制膠、上樣及電泳過程而耗費一定的人力和時間。DNA上樣量較大，存在DNA浪費情況，不適用于稀少樣本的DNA檢測。為避免電泳過程中DNA損失，DNA樣品上樣時需與loading buffer進行混合。此外，電泳后DNA條帶的敏感性差，微量DNA上樣時更不易觀察結果。分光光度儀法是檢測DNA濃度的常用方法，但有時受到儀器性能的限制，待檢測DNA樣本的原始用量較大、操作繁瑣、易出現誤差。DNA量不足時，吸光度檢測結果不可信。因此，盡管以上方法被廣泛應用于研究領域，但還存在一定的弊端。

本研究提出的“改良EB染色法”在一定程度上解決了前述方法的一些弊端。首先，顯著提高了DNA檢測敏感度，較低濃度的DNA也可被檢出，同時本方法也可根據斑點亮度來初步估計DNA量的多少。其次，因本方法敏感度高，可減少DNA樣本的上樣量，節省了樣本，尤其在稀有DNA樣本的處理中更具有意義。本研究中，改良法的基因組用量僅2 μL即可觀察到斑點顏色改變。第三，操作簡便省時，節省實驗用品。20個樣本瓊脂糖凝膠電泳約需要2 h；而本方法僅需要2～3 min即可，節省操作時間。另外，在實驗的用材方面改良法只需少量的封口膜和0.5 μg/mL EB一種溶液，從而大幅度簡化了檢測程序，降低了實驗成本。

本方法在使用中也具有一定的局限性。因其不能評估DNA片段長度，因此更適用于基因組DNA提取后的初步篩檢和對基因組DNA濃度的粗略估測，不適合用于驗證PCR結果。本方法可與瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度儀法協同使用，在精確檢測的基礎上，將更加快速、簡便。

［1］Wellcome Trust Case Control Consortium，Craddock N，Hurles ME，et al.Genome-wide association study of CNVs in 16，000 cases of eight common diseases and 3，000 shared controls［J］.Nature，2010，464（7289）：713-720.

［2］Vonholdt BM，Pollinger JP，Lohmueller KE，et al.Genome-wide SNP and haplotype analyses reveal a rich history underlying dog domestication［J］.Nature，2010，464（7290）：898-902.

［3］朱英，陶剛，劉作易，等.瓊脂糖凝膠電泳操作中值得注意的幾個問題［J］.貴州農業科學，2004，32（6）：27-28.

［4］黃永蓮.瓊脂糖凝膠電泳實驗技術研究［J］.湛江師范學院學報，2009，30（6）：83-85.

［5］孫巖，李武修，唐勝建.瓊脂糖凝膠厚度對DNA電泳的影響［J］.濰坊醫學院學報，2005，27（2）：103-107.

［6］Pierce BL，Ahsan H.Genome-wide"pleiotropy scan"identifies HNF1A region as a novel pancreatic cancer susceptibility locus［J］. Cancer Res，2011，71（13）：4352-4358.

［7］Rasmussen-Torvik LJ，Li M，Kao WH，et al.Association of a fasting glucose genetic risk score with subclinical atherosclerosis：The Atherosclerosis Risk in Communities（ARIC）study［J］.Diabetes，2011，60（1）：331-335.

［8］Brockschmidt A，Filippi A，Charbel Issa P，et al.Neurologic and ocular phenotype in Pitt-Hopkins syndrome and a zebrafish model［J］. Hum Genet，2011，130（5）：645-655.

（編輯 于 溪）

An Improved Ethidium Bromide Staining Method for Rapid Detection ofGenomic DNA

TIAN Xiu-rong1，GUOLi2，GAOBing1，LIUJian1

（1.Cell Biology and Genetics Department of Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Science Experiment Center of Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China）

Objective To explore a genome DNA detection method with less time-consuming and high detection rate.MethodsGenomic DNA samples were extracted and detected with improved ethidium bromide staining method.The sensitivity was verified with spectrophotometer meter. Polymerase chain reaction was used to confirm whether the method was available for detecting the PCR product.ResultsThe improved ethidium bromide staining method significantly reduced the quantity of genomic DNA sample applied to gel，improved the detection sensitivity of genomic DNA and saved operating time with no need for loading buffer.In addition，it can roughly estimate the concentration of genomic DNA.ConclusionThe improved ethidium bromide staining method can be applied to screening genomic DNA sample，but it cannot assess the length of DNA fragments.

agarose gel electrophoresis；genomic DNA；ethidium bromide

O657

B

0258-4646（2015）11-0999-03

田秀榮（1963-），女，高級實驗師，大專. E-mail：tianxiurong2008@163.com

2015-01-26

網絡出版時間：