PDCD5基因對順鉑在裸鼠A549肺癌中療效的協同作用

梅同華，戴玲麗，張明川

（1.重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸內科，重慶 400016；2.南昌市第三醫院呼吸內科，南昌 330006；3.重慶市銅梁區人民醫院呼吸內科，重慶 402560）

PDCD5基因對順鉑在裸鼠A549肺癌中療效的協同作用

梅同華1，戴玲麗2，張明川3

（1.重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸內科，重慶 400016；2.南昌市第三醫院呼吸內科，南昌 330006；3.重慶市銅梁區人民醫院呼吸內科，重慶 402560）

目的探討PDCD5基因聯合順鉑對于裸鼠A549肺癌的治療作用。方法建立裸鼠A549肺癌模型，將25只裸鼠隨機分為5組（每組5只）：空白對照（N-null）組、脂質體-pcDNA3.1（lip-null）組、脂質體-PDCD5（lip-PDCD5）組、順鉑（DDP）組和聯合治療（PDCD5+DDP）組。觀察腫瘤生長情況，繪制腫瘤生長曲線圖；原位TUNEL法檢測細胞凋亡情況；免疫組化法及Western blot法檢測PDCD5、bcl-2、survivin蛋白表達情況。結果PDCD5+DDP組與lip-PDCD5組或DDP組相比，腫瘤的生長明顯抑制（P＜0.05）。TUNEL結果顯示，PDCD5+DDP組細胞凋亡率較lip-PDCD5組或DDP組增高（P＜0.05）。免疫組化及Western blot結果顯示，lip-PDCD5組和PDCD5+DDP組裸鼠肺癌組織中PDCD5呈高表達，bcl-2、survivin蛋白呈低表達，兩者呈負相關（P＜0.05）。結論PDCD5基因能增強順鉑誘導肺癌細胞凋亡的敏感性，為肺癌的基因治療提供了一條新策略。

PDCD5；順鉑；肺癌；聯合治療

肺癌是當前高發病率和高死亡率的惡性腫瘤之一，已成為我國居民的重要死因之一。肺癌的傳統治療包括手術治療、放射治療和化學藥物治療。研究表明肺癌早期發現率僅為15%左右，在診斷時往往已是中晚期，且有約30%的晚期患者對化療藥物不敏感，以上因素導致肺癌的低生存率［1，2］。因此，越來越多的研究者致力于基因靶向藥物的研究，以提高肺癌治療的有效性。細胞程序性死亡基因5（programmed cell death 5 gene，PDCD5），原名TFAR-19，是近年來發現的一個細胞凋亡正調控基因，有研究發現PDCD5可以促進凋亡誘導因子發揮凋亡作用［3，4］。且有研究發現PDCD5基因可以增加順鉑誘導前列腺細胞和胃癌細胞凋亡的敏感性，兩者可能有協同作用［5，6］。本研究就PDCD5基因協同順鉑治療非小細胞肺癌的作用進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

pcDNA3.1-PDCD5重組質粒購自北京鼎國生物科技公司；lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；人肺癌A549細胞由重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸科實驗室贈送；1640胎牛血清購自美國Gibico公司；Balb/C裸鼠（4～6周齡，雌性）購自重慶醫科大學動物中心；順鉑購自美國Selleckchem公司；兔抗人PDCD5多克隆抗體購自英國Abcam公司；bcl-2多克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體購自武漢三鷹生物公司；兔抗人survivin抗體購自德國CST公司。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司，原位TUNEL檢測試劑盒購自羅氏公司。

1.2 A549肺癌裸鼠模型的建立及實驗設計

體外培養A549細胞，取對數期生長的細胞，以0.25%胰酶消化，用計數板計數，調整濃度至1×107/mL。每只裸鼠右側背下皮膚接種0.1 mL（每只接種1×106個細胞）。皮下瘤體積長至50～100 mm3時進行隨機分組，每組5只，分為空白對照組（N-null組，每只100 μL生理鹽水）、脂質體-pcDNA3.1組（lip-null組，每只100 μL脂質體-pcDNA3.1復合物，含10 μg質粒）、脂質體-PDCD5組（lip-PDCD5組，每組100 μL脂質體-PDCD5復合物，含10 μg質粒）、順鉑組（DDP組，DDP 2 mg/kg）和聯合治療組（PDCD5+DDP組，每只100 μL脂質體-pcDNA3.1復合物，含10 μg質粒，DDP 2 mg/kg）。0.9%生理鹽水、脂質體-質粒復合物為瘤旁注射，隔日1次，共9次。順鉑為腹腔注射，每3 d 1次，共5次。觀察腫瘤生長情況，治療開始后每隔1 d用游標卡尺測量腫瘤的最長直徑及寬徑，計算腫瘤體積：V（mm3）=1/6×π×長×寬2。最后一次給藥后1 d處死裸鼠，取腫瘤組織，固定于4%甲醛中，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，組織切片（厚度4 μm）。用作HE染色、免疫組化和原位TUNEL檢測。

1.3 TUNEL法檢測凋亡

按羅氏TUNEL試劑盒實驗步驟操作，光學顯微鏡下觀察各組細胞凋亡情況。結果判定：凋亡細胞核呈棕黃色或黃色，符合凋亡特征。隨機選取5個高倍視野（×400），分別計算視野中的陽性染色細胞與細胞總數的比例作為凋亡指數。

1.4 免疫組化

采用S-P法進行，PBS稀釋一抗：PDCD5（1∶1 000）、bcl-2（1∶40）和survivin（1∶400）。嚴格按照S-P試劑盒步驟操作，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。用已知陽性表達PDCD5的肺癌組織做陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照。顯微鏡下閱片。結果判定：由2位以上病理科醫師閱片，胞質和（或）胞核著色棕黃色顆粒為陽性表達細胞，每張切片隨機選取5個高倍視野（×400），共計數100個細胞，按顯色程度和陽性細胞百分比總和計分：無色為0分；細胞百分比＜10%、淡黃色為1分；10%～50%、棕黃色為2分；＞50%、棕褐色為3分。兩者相乘之積為總分，總分≥3為陽性。

1.5 Western blot檢測蛋白表達

用細胞裂解液將腫瘤組織中細胞裂解，提取細胞總蛋白并進行定量，SDS-PAGE凝膠電泳，按抗體說明書比例進行一抗、二抗孵育，暗室曝光觀察蛋白表達情況。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 PDCD5及PDCD5聯合順鉑對于裸鼠原位瘤的抑制作用

在第14天即注射開始第1天時，N-null組、lipnull組、lip-PDCD5組、DDP組和PDCD5+DDP組裸鼠的腫瘤體積分別為（104.81±6.30）mm3、（110.76± 5.67）mm3、（110.87±6.35）mm3、（108.88±0.91）mm3和（108.75±1.50）mm3，無統計學差異（P＞0.05）。治療后5組裸鼠腫瘤體積分別為（1 296.93±61.44）mm3、（1 272.89±99.24）mm3、（969.06±22.70）mm3、（954.63± 19.63）mm3和（446.40±19.38）mm3，PDCD5+DDP組腫瘤體積較lip-PDCD5組或DDP組明顯減小（P＜0.05），lip-PDCD5組和DDP組較N-null組或lip-null組腫瘤體積亦顯著減小（P＜0.01）。見圖1。

2.2 TUNEL檢測細胞凋亡結果

N-null組和lip-null組僅見少數幾個凋亡細胞，lip-PDCD5組和DDP組可見部分凋亡細胞，而PDCD5+DDP組凋亡細胞顯著增多，見圖2。N-null組、lip-null組、lip-PDCD5組、DDP組和PDCD5+DDP組細胞凋亡指數分別為（1.72±1.11）%、（1.77± 1.29）%、（3.84±0.98）%、（13.08±1.59）%和（25.33± 4.73）%，PDCD5+DDP組與lip-PDCD5組、DDP組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 免疫組化結果

圖1 治療開始后裸鼠生長曲線Fig.1 Tumor growth curve after treatment

圖2 TUNEL檢測各組細胞凋亡結果 ×400Fig.2 Apoptotic index by TUNEL in each group×400

lip-PDCD5組及PDCD5+DDP組PDCD5蛋白表達水平明顯高于N-null組、lip-null組和DDP組（P＜0.01）；lip-PDCD5組及PDCD5+DDP組bcl-2蛋白及survivin蛋白表達水平明顯低于N-null組、lip-null組和DDP組（P＜0.01）；lip-PDCD5組及PDCD5+DDP組與N-null組、lip-null組和DDP組兩兩比較，PDCD5蛋白、bcl-2蛋白及survivin蛋白的表達均有統計學差異（P＜0.01）。見表1、圖3。

2.4 Western blot結果

表1 免疫組化檢測各組PDCD5、bcl?2及survivin蛋白的表達Tab.1 Immunohistochemical observation of PDCD5，bcl?2 and survivin in each group

lip-PDCD5組及PDCD5+DDP組PDCD5蛋白表達水平明顯高于N-null組、lip-null組和DDP組；lip-PDCD5組及PDCD5+DDP組bcl-2蛋白及survivin蛋白表達水平明顯低于N-nul組、lip-null組和DDP組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

3 討論

PDCD5基因是從白血病TF-1細胞中克隆得到的一個凋亡正調控基因，低表達于許多惡性腫瘤，如胃癌、宮頸癌和多發性骨髓瘤等［7～9］。近來研究發現在肺癌組織中PDCD5也呈低表達，且在PDCD5基因上游有一個片段與肺癌的發病密切相關［10，11］。在進一步的研究中發現，將PDCD5重組蛋白聯合依托泊苷、順鉑、卡鉑及長春新堿等化療藥物用于腫瘤細胞株時，包括白血病、神經膠質瘤等，可以明顯增強以上化療藥物的敏感性［12，13］。由此可知，PDCD5基因可能與肺癌的發生發展密切相關，且聯合化療藥物可發揮協同抗腫瘤的作用。

圖3 免疫組化檢測PDCD5、bcl?2和survivin蛋白表達 ×400Fig.3 Immunohistochemical observation of PDCD5，bcl?2 and survivin in each group×400

圖4 Western blot檢測PDCD5、bcl?2及survivin蛋白表達Fig.4 Western blot observation of PDCD5，bcl?2 and survivin in each group

因此本研究中我們設計了相應體內實驗：構建裸鼠肺腺癌A549模型，設置N-null組、lip-null組、lip-PDCD5組、DDP組和PDCD5+DDP組進行治療。通過繪制腫瘤體積生長曲線可以觀察裸鼠移植瘤抑制情況，從生長曲線圖中可以觀察到PDCD5+ DDP組裸鼠的移植瘤體積較lip-PDCD5或DDP單藥組小，較N-null組則是明顯減小（P＜0.05），此結果表明PDCD5重組質粒聯合DDP能夠明顯抑制腫瘤的生長。另外用TUNEL法檢測移植瘤細胞凋亡情況，結果顯示lip-PDCD5和DDP單藥組僅見少數凋亡細胞，而PDCD5+DDP組較lip-PDCD5及DDP單藥組比較細胞凋亡明顯（P＜0.05）。2種實驗結果證實PDCD5協同順鉑可以發揮明顯的腫瘤抑制效應。

目前對于PDCD5增加順鉑化療敏感性的具體機制尚不明了，近年來的研究提示可能與caspase依賴的細胞凋亡通路有關［14］。bcl-2家族是PDCD5促凋亡機制中一條重要通路，研究指出PDCD5可以通過調節bcl-2家族蛋白表達，影響線粒體轉位，最終抑制caspase-3活性來發揮促凋亡效應［14，15］。Chen等［16］研究發現PDCD5能夠增強順鉑在軟骨肉瘤細胞中的化療敏感性，在研究中亦發現其可能是通過上調bax蛋白和下調bcl-2蛋白的表達，進一步使caspase-3活性減弱，從而實現細胞凋亡的。由此可推測PDCD5基因可能是通過調節bcl-2家族蛋白的表達從而實現對順鉑的增敏作用的。survivin蛋白是凋亡抑制蛋白家族成員，具有非常強的抑制凋亡作用［17，18］。張梅春等［19］利用脂質體包裹survivin反義核苷酸轉染入A549細胞中，下調survivin的表達，發現其逆轉了細胞對順鉑誘導凋亡的耐受性，增強了A549細胞對順鉑的敏感性。在本研究中，我們采用免疫組化方法檢測了PDCD5蛋白及某些腫瘤相關蛋白的表達，如bcl-2、survivin等，結果顯示含PDCD5組PDCD5蛋白高表達的同時bcl-2及survivin蛋白呈低表達，呈負相關。結果提示PDCD5基因可能是通過調節bcl-2及survivin基因的表達來實現對順鉑的增敏作用。

本研究提示了PDCD5基因在肺癌治療中與順鉑的協同作用，且初步探索了其可能機制，為其用于提高順鉑在肺癌治療中的敏感性奠定了基礎。

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（編輯 陳 姜）

Synergistic Effectsof PDCD5and Cisplatin in Lung Cancer Treatmentin Mice Model

MEITong-hua1，DAILing-li2，ZHANG Ming-chuan3

（1.Department of Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Department of Respiratory Medicine，The Third Hospital of Nanchang，Nanchang 330006，China；3.Department of Respiratory Medicine，Tongliang People’s Hospital of Chongqing，Chongqing 402560，China）

Objective To determine the antitumor effects of PDCD5recombinant plasmid in combination with cisplatin in lung carcinoma models.MethodsA549 lung cancernude mice model was established，and then the 25 mice were randomly divided into five groups.The tumorvolume was calculated and a tumor growth curve was recorded.The apoptosis rates were measured by TUNEL.The expression of PDCD5 and tumor-associated protein were examined by immunohistochemistry method.ResultsThe apoptosis rates of the A549 cells transfected by PDCD5recombinant plasmid were significantly higher than other groups（P＜0.05）.Mouse treated with PDCD5 and DDP showed more effective tumor inhibition（P＜0.05）. TUNEL analysis of tumors exhibited that PDCD5 in combination with cisplatin led to an increased rate of apoptosis（P＜0.05）.Mouse treated with PDCD5 had an higher expression of PDCD5 protein and lower expression of bcl-2 and survivin protein than other groups（P＜0.05）.ConclusionOur study demonstrated that PDCD5gene sensitizes A549 cellsto cisplatin-induced apoptosis，and provide a new strategy for gene therapy.

PDCD5；cisplatin；lung cancer；combination therapy

R734.2

A

0258-4646（2015）11-1002-04

江西省科技支撐計劃項目（20121BBG70053）

梅同華（1954-），女，主任醫師，本科.

戴玲麗，E-mail：dailingli13@126.com

2015-03-03

網絡出版時間：