miR?24對大鼠脊髓損傷后運動功能的影響

張男，趙茗，申勇，孫亞澎

（河北醫科大學第三醫院脊柱外科，石家莊 050051）

miR?24對大鼠脊髓損傷后運動功能的影響

張男，趙茗，申勇，孫亞澎

（河北醫科大學第三醫院脊柱外科，石家莊 050051）

目的觀察miR-24對大鼠脊髓損傷后運動功能恢復的影響。方法健康成年Sprague-Dawley大鼠60只，隨機分為miR-24組、對照組和假手術組（Sham組），每組20只。Sham組只暴露脊髓，不打擊。對照組和miR-24組采用Allen’s方法損傷大鼠T9脊髓節段，制備脊髓損傷動物模型。造模成功后30 min，miR-24組鞘內注射agomir-24（0.5 nmol/L，5 μL），對照組鞘內注射等量的agomir對照，每日1次，共3次。采用BBB評分法分析大鼠后肢運動功能，實時PCR檢測脊髓組織中miR-24表達水平，HE染色觀察大鼠脊髓組織病理形態學變化，實時PCR和Western blot檢測脊髓組織中Bim mRNA和蛋白的表達水平。結果與Sham組相比，對照組大鼠損傷后1、3、7和14 d脊髓組織中miR-24表達均降低，其中3、7及14 d差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組相比，miR-24組大鼠損傷后3、7和14 d BBB評分均顯著升高（P＜0.05）；損傷后1和3 d脊髓損傷形態學均有改善，損傷后3 d改善更明顯；損傷后1和3 d脊髓組織Bim mRNA和蛋白的表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結論miR-24可能通過抑制Bim的表達，促進脊髓損傷大鼠運動功能的恢復。

脊髓損傷；miR-24；agomir-24；Bim；細胞凋亡

脊髓損傷是一種嚴重的中樞神經系統創傷，導致損傷部位以下運動和感覺功能障礙［1］。脊髓損傷嚴重的病理后果和高昂的治療費用給患者帶來極大的痛苦，同時也成為巨大的社會醫療負擔。但是目前尚無能治愈脊髓損傷的醫療措施，因此脊髓損傷的修復和康復治療的研究具有重要的臨床意義。MicroRNA（簡稱miRNA）是一類廣泛存在于真核生物中、長度為22～28個核苷酸、含量豐富的非編碼小RNA，其通過與靶mRNA的3′非翻譯區互補配對，抑制蛋白合成或誘導mRNA降解，從而實現在轉錄后水平對目的基因表達進行負性調控［2］，調節細胞的代謝、增殖、分化和凋亡等生理過程。近來研究表明，若干miRNA在脊髓損傷中的表達水平有不同程度的上調或下調，提示脊髓損傷的發生與miRNA之間存在一定的相關性［3］。但有關miR-24在脊髓損傷中的作用及可能的作用機制目前尚不清楚。

本研究通過髓鞘內注射agomir-24以提高脊髓中miR-24含量，觀察agomir-24注射后大鼠后肢運動功能變化、大鼠脊髓損傷組織病理變化及Bim的表達水平，明確miR-24對脊髓損傷后大鼠運動功能的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級成年健康Sprague-Dawley大鼠60只，雌雄不限，體質量（250±20）g，購自河北醫科大學實驗動物中心。將大鼠隨機分為miR-24組、對照組和假手術組（Sham組），每組20只。

1.2 主要試劑和儀器

agomir-24及對照購自廣州市銳博生物科技有限公司；β-actin小鼠單克隆抗體和Bim小鼠單克隆抗體購自美國Abcam公司；羊抗小鼠IgG-HRP購自北京中杉金橋生物技術公司。全自動酶標儀和電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Dounce勻漿器（美國Wheaton公司）；-80℃超低溫冰箱（美國Thermo公司）；高速冷凍離心機（美國Eppendorf公司）；MX3000P Real-time PCR擴增儀（美國Agilent公司）。

1.3 模型制備與agomir-24干預

參照Allen’s方法制作大鼠脊髓損傷模型。擊打棍由不銹鋼材料制成，直徑4.0 mm，質量20 g，擊打棍套管內直徑4.1 mm，打擊高度為2.5 cm，以出現脊髓充血、雙下肢痙攣抖動、尾巴痙攣性擺動視為造模成功。術后立即腹腔注射0.9%氯化鈉注射液9 mL/kg以補液。術后3 d內，每天腹腔注射8×104U青霉素鈉以防感染。術后大鼠可自由飲水、進食，飼養環境中須保持適宜的溫度和濕度，定時清潔籠具，并保持大鼠身體干燥，每天擠壓膀胱排尿3次，至大鼠恢復自主排尿。造模成功后30 min，miR-24組鞘內注射5 μL agomir-24（0.5 nmol/L），每日注射1次，共3次。對照組造模成功后鞘內注射等量的agomir對照。

1.4 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分

損傷后1、3、7和14 d分別從對照組和miR-24組隨機抽取5只大鼠進行BBB評分，以分析后肢運動功能。評分標準：第1步（0～7分）評判動物后肢各關節活動；第2步（8～13分）評判動物后肢的步態和協調功能；第3步（14～21分）評估動物運動時爪子的精細運動。3項滿分21分。采用雙盲法，每次評分由經培訓后的2人分別獨立完成，左右兩側分別評分后取平均值作為最后評分。

1.5 HE染色

損傷后1和3 d分別從對照組和miR-24組隨機抽取5只大鼠，取嚴重段脊髓組織制備組織石蠟切片，每只大鼠隨機選取2張切片進行HE染色，光鏡下觀察脊髓組織形態學變化。

1.6 實時PCR

取新鮮脊髓組織，根據Trizol操作說明，提取細胞總RNA。提取的總RNA定量后，對于蛋白編碼基因使用Oligo（dT）作為逆轉錄引物，對于miRNA使用miRNA特異的逆轉錄引物，使用反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈。使用適量的cDNA作為PCR模板，MX3000P Real-time PCR擴增儀進行PCR反應，SYBR染料實時檢測擴增產物的量，以GAPDH為內參分析蛋白編碼基因表達情況，以U6為內參分析miRNA的表達情況。所使用引物序列如下：Bim引物序列：5′-GCCCCTACCTCCCTACAGAC-3′（F），5′-ATGGTGGTGGCCATACAAAT-3′（R）；miR-24引物序列：GCTCTGGCTCAGTTCAGCAGG（F），CAGTGC AGGGTCCGAGGT（R）；U6引物序列：CTCGCTTCGG CAGCACATATACT（F），ACGCTTCACGAATTTGCG TGTC（R）；GAPDH引物序列：TCAACGACCACTTTG TCAAGCTCA（F），GCTGGTGGTCCAGGGGTCTTACT（R）。

1.7 Western blot

收集新鮮脊髓組織并提取蛋白，上樣蛋白30 μg，電泳（10%SDS-PAGE凝膠），轉印（70 V，120 min），5%正常小牛血清封閉、抗Bim（1∶1 000，美國Abcam公司）和抗β-actin（1∶1 000，美國Abcam公司），4℃孵育過夜，分別與各自對應的二抗（北京中杉公司）室溫孵育2 h，加ECL顯色劑（北京中杉公司）1 min，X線膠片曝光成像。結果經自動電泳凝膠成像分析儀（Chemi Image 5500，美國Alpha Innotech公司）采集，進行灰度值分析。

1.8 統計學分析

應用SPSS 17.0軟件包進行統計學分析。計量指標采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠脊髓損傷組織中miR-24的表達

利用實時PCR檢測脊髓損傷后1、3、7和14 d大鼠脊髓組織中miR-24的表達（圖1）。可見Sham組各時間點大鼠脊髓組織miR-24表達無顯著改變；與Sham組相比，對照組大鼠各時間脊髓組織miR-24表達均降低，損傷后3、7和14 d時2組的差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 大鼠脊髓損傷組織中miR?24的表達Fig.1 The expression of miR?24 in spinal cord tissue of rat after injury

2.2 agomir-24鞘內注射對大鼠脊髓損傷組織中miR-24表達的影響

采用實時PCR檢測鞘內注射agomir-24對損傷脊髓組織中miR-24表達的影響。與對照組相比，miR-24組大鼠脊髓組織中miR-24表達顯著升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 agomir?24對大鼠脊髓損傷組織中miR?24表達的影響Fig.2 Effects of agomir?24 on the expression of miR?24 in spinal cord tissue of rat after injury

2.3 agomir-24鞘內注射對大鼠運動功能的影響

采用BBB評分方法評估agomir-24注射對大鼠運動功能的影響。與對照組相比，miR-24組大鼠BBB評分均增高，其中損傷后3、7、14 d評分顯著增加（P＜0.05）。見圖3。

2.4 agomir-24鞘內注射對大鼠脊髓組織形態學的影響

對照組大鼠脊髓出現典型的損傷改變，表現為炎性細胞增多，神經元水腫、變形，空泡形成。miR-24組大鼠脊髓損傷明顯減輕。見圖4。

2.5 agomir-24鞘內注射對脊髓組織中Bim表達的影響

實時PCR檢測Bim mRNA表達水平，Western blot檢測Bim蛋白表達水平。與對照組相比，脊髓損傷后1和3 d，miR-24組大鼠脊髓損傷組織中Bim mRNA和蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

作為miRNA的一員，miRNA-24同樣擁有典型的發卡結構，便于miRNA-24與靶基因mRNA的結合。目前研究表明，miRNA-24在心肌缺血、腫瘤發生等病理生理過程中發揮著重要功能。有研究報道miRNA-24與細胞凋亡相關，具有抑制細胞凋亡的作用［3，4］。另有研究表明miRNA-24參與細胞分化的過程，可能通過抑制Trib3表達促進胚胎干細胞向造血細胞分化［，5］。此外，miRNA-24通過調節細胞增殖參與腫瘤發生發展的過程，但表現不一，其中miRNA-24通過MAPK信號通路增強粒細胞的增殖，進而參與急性髓系白血病發生發展［6］，相反miRNA-24則可抑制骨肉瘤U-2OS細胞的增殖［7］。近來有研究發現，脊髓損傷組織中miR-24低表達，提示miR-24可能參與脊髓損傷的發生發展過程中，但其確切作用及可能機制尚不清楚［8］。

圖4 各組大鼠損傷后3 d脊髓組織形態學變化 HE×20Fig.4 Morphological changes of spinal cord tissue 3 days after the injury HE×20

圖5 各組大鼠脊髓損傷組織中Bim的表達Fig.5 Bim expression in spinal cord tissue of rats in each group after the injury

本研究首先檢測了脊髓損傷大鼠脊髓組織中miR-24的表達，以明確miR-24是否參與大鼠脊髓損傷過程，結果發現脊髓損傷組織中miR-24表達顯著降低，這與以往報道一致［9］。為進一步明確miR-24是否參與脊髓損傷的修復，我們進一步通過鞘內注射agomir-24以增加脊髓中miR-24，評價miR-24增加對脊髓損傷的修復作用。結果發現，鞘內注射agomir-24后，miR-24表達顯著增加，脊髓損傷大鼠后肢功能恢復，脊髓損傷病理形態學明顯改善，這提示miR-24可促進大鼠脊髓損傷的修復。

細胞凋亡作為脊髓損傷的重要機制之一，長久以來一直是這方面研究的熱點，其中凋亡蛋白家族Bcl-2家族一直都是重點研究對象。Bim屬于Bcl-2家族蛋白的促凋亡蛋白，其在多種組織中表達，并參與各種病變或損傷引起的病理過程。Bim的功能主要是誘導細胞凋亡，在神經系統和免疫系統中的大部分細胞凋亡過程都是由Bim所介導的。Qian等［9］研究發現miR-24可通過靶向沉默Bim抑制小鼠心肌細胞的凋亡，提示Bim可作為miR-24的靶基因。那么miR-24是否可以通過靶向沉默Bim促進脊髓損傷修復，目前尚無清楚。

為了進一步明確miR-24參與脊髓損傷修復的分子機制，本研究通過分析髓鞘注射agomir-24后miR-24的靶基因之一Bim表達變化，以分析miR-24可否通過靶向沉默Bim促進脊髓損傷修復。結果發現，agomir-24鞘內注射后，Bim mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，提示miR-24通過抑制Bim表達，促進大鼠脊髓損傷的修復。

本研究結果證明，miR-24對脊髓損傷后大鼠運動功能恢復有促進作用，其可能機制與其靶向沉默Bim有關，這為miR-24在脊髓損傷治療的臨床應用提供了一定的理論基礎。但miR-24的作用是否受到細胞內其他信號分子的調控，其對脊髓損傷的治療效果是否受到劑量的影響等，還有待深入研究。

［1］張華，白金柱.脊髓損傷后皮質脊髓束的相關研究進展［J］.中國康復理論與實踐，2013，19（4）：349-353.

［2］Dong J，Lu M，He X，et al.Identifying the role of microRNAs in spinal cord injury［J］.Neurol Sci，2014，35（11）：1663-1671.

［3］Wang L，Qian L.miR-24 regulates intrinsic apoptosis pathway in mouse cardiomyocytes［J］.PLoS One，2014，9（1）：e85389.

［4］Guo C，Deng Y，Liu J，et al.Cardiomyocyte-specific role of miR-24 in promoting cell survival［J］.J Cell Mol Med，2015，19（1）：103-112.

［5］Roy L，Bikorimana E，Lapid D，et al.MiR-24 is required for hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells［J］.PLoS Genet，2015，11（1）：e1004959.

［6］Zaidi SK，Dowdy CR，van Wijnen AJ，et al.Altered Runx1 subnuclear targeting enhances myeloid cell proliferation and blocks differentiation by activating a miR-24/MKP-7/MAPK network［J］.Cancer Res，2009，69（21）：8249-8255.

［7］梁德勇，陳升，王野，等.miR-24-2對人骨肉瘤細胞系U-2OS體外增殖能力的影響［J］.中國醫科大學學報，2014，43（5）：393-395.

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（編輯 陳 姜）

Effect of miR-24 on the Motor Function after Spinal Cord Injury in Rats

ZHANGNan，ZHAOMing，SHENYong，SUNYa-peng

（Department of Spine Surgery，The Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang050051，China）

Objective To observe the effect of miR-24 on the motor function after spinal cord injury（SCI）in rats，and explore the related mechanism.MethodsA total of 60 healthy adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group，sham group and miR-24 group with 20 rats in each group.SCI model was made by Allen′s mode at the level of the 9th thoracic vertebra.30 min after SCI model was made，rats in miR-24 group were given agomir-24（0.5 nmol/L，5μL）daily for3 times by intrathecally injection，while rats in control group were given an equal volume of agomir control.The motor function was evaluated by BBB score.The miR-24expression in spinal cord tissue was detected by real-time PCR.The pathological change of spinal cord tissue was observed by HE staining.The Bim mRNA and protein expression in spinal cord tissue were detected by real-time PCR and Western blot，respectively.ResultsCompared with that in sham group，miR-24expression in spinal cord tissue of rats from control group was decreased at 1 d，3 d，7 d and 14 d after injury，and the difference was significant at 3 d，7 d and 14 d（P＜0.05）.Compared with that in control group，BBB score in rats from miR-24 group was significantly increased at 3 d，7 d and 14 d after injury（P＜0.05）.The morphology of spinal cord injury in rats from miR-24 group was improved at 1 d，3 d after injury，and the effect was more significantly at 3 d after injury.The mRNA and protein expression of Bim in spinal cord tissue of rats from miR-24 group were all decreased significantly after injury（P＜0.05）.Con?clusionmiR-24 promote the recovery of motor function of rats with spinal cord injury by inhibiting the expression of Bim.

spinal cord injury；miR-24；agomir-24；Bim；apoptosis

R651.2

A

0258-4646（2015）11-1012-05

張男（1983-），男，主治醫師，碩士.

申勇，E-mail：shenyongsy@gmail.com

2015-05-26

網絡出版時間：