氧化苦參堿對H9c2心肌細胞氧化應激損傷的保護作用及其機制

趙陽(延安大學咸陽醫院，陜西咸陽712099)

氧化苦參堿對H9c2心肌細胞氧化應激損傷的保護作用及其機制

趙陽
(延安大學咸陽醫院，陜西咸陽712099)

摘要:目的研究氧化苦參堿對于由H2O2所致的H9c2細胞氧化應激損傷的保護作用及其作用機制。方法建立H9c2心肌細胞氧化應激損傷模型，取對數生長期細胞，將細胞隨機分成4組:①正常對照組，不加任何處理因素;②模型組:在細胞培養基中加入終濃度為200 μmol/L H2O2培養6 h;③苦參堿低、高劑量組:在細胞培養基中加入低、高濃度(20、60 μmol/L)的苦參堿培養12 h，再加入終濃度為200 μmol/L的氧化應激繼續培養6 h。采用MTT法檢測細胞存活率，收集細胞上清及培養基，采用ELISA法檢測丙二醛(MDA)水平及乳酸脫氫酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，流式細胞術檢測細胞的凋亡率，Western blotting法檢測p-AKT、AKT、p-Bad、Bad、Bcl-2、Bax蛋白。結果與正常對照組比較，模型組細胞存活率降低、調亡率升高，細胞上清液中LDH活性增強、SOD活性減弱、MDA水平升高，p-AKT、Bcl-2、p-Bad蛋白水平降低，Bax升高(P均＜0.05)。與模型組比較，苦參堿低、高劑量組細胞存活率提高，凋亡率降低，細胞上清液中MDA水平降低以及LDH活性減弱，SOD活性增強，p-AKT、Bcl-2、p-Bad蛋白表達量升高，Bax的表達降低(P均＜0.05)。結論苦參堿可以通過影響p-AKT及其下游蛋白Bad表達，對H9c2心肌細胞由H2O2引起的氧化應激損傷起保護作用。

關鍵詞:氧化應激損傷;過氧化氫;氧化苦參堿;凋亡; Bad

氧化應激是造成心血管系統結構功能異常的重要原因，與心血管疾病如動脈粥樣硬化、高血壓等具有密切聯系。H2O2是一種活性氧，具有高反應性，可以促進氧自由基的生成，并可呈濃度和時間依賴性誘導心肌凋亡。因此常被用于心血管系統氧化應激的基礎醫學研究。氧化苦參堿(苦參素)是從中藥苦參、苦豆子、廣豆根等植物中提取的生物堿。氧化苦參堿藥理作用廣泛，具有抗病毒、強心、降壓、抗炎、殺菌、抗腫瘤以及鎮靜催眠、解熱鎮痛、抗過敏等作用［1～5］。研究表明，氧化苦參堿對大鼠急性缺血損傷的心肌具有保護作用，其機制可能與抑制脂質過氧化和增加內生性抗氧化劑活性，保護線粒體的結構和功能從而減少細胞凋亡有關［6］。2014年3～7月，本研究旨在從細胞水平探討氧化苦參堿對于心肌細胞損傷是否具有保護作用以及其作用機制。

1　材料與方法

1.1材料H9c2心肌細胞(來自本實驗室):接種于含10%胎牛血清(美國HyClone公司)的高糖DMEM(美國Gibico公司)培養基中，細胞孵箱(美國Thermo公司)培養，培養條件為5% CO2、37℃。待細胞匯合度達到80%～90%時，用0.25%胰酶進行消化，以1∶4比例進行傳代培養。試劑及儀器:酶標儀、電泳儀、轉膜儀(美國Biord公司);mTT溶液、化學發光試劑盒(上海，碧云天);流式細胞儀(FACS Calibur，BD公司);丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化歧化酶(SOD)檢測試劑盒(南京建成)。

1.2氧化應激損傷模型的建立及分組將H9c2細胞按照5×105/mL分別接種于96孔板和6孔板。實驗開始時細胞均更換新鮮無血清培養液。按隨機原則分為5組:①對照組，不加任何處理因素;②模型組:在細胞培養基中加入終濃度為200 μmol/L H2O2培養6 h;③苦參堿低、高劑量組:在細胞培養基中加入低、高濃度(20、60 μmol/L)的苦參堿培養12 h，再加入終濃度為200 μmol/L的H2O2繼續培養6 h。

1.3心肌細胞存活率的檢測采用MTT法。將H9c2細胞制成單細胞懸液，調整細胞數為1×105/mL，按200 μL/孔接種于96孔板中，37℃、5% CO2培養6 h貼壁后，按照上述各實驗分組處理細胞，然后每孔中加入20 μLmTT溶液，37℃、5% CO2培養箱中培育4 h，加入150 μLdMSO溶液，在490 nm波長測定吸光度(A)值，設置不加細胞只加培養液的空白對照組，比色時作為空白調零孔，每組重復8

孔。細胞存活率(%)=處理組A值/空白對照組A 值×100%。

1.4心肌細胞中SOD、LDH活性及MDA水平的檢測采用ELISA法。將H9c2細胞按5×105/mL接種6孔板，按上述實驗分組處理后，取其上清液測定LDH活性。將6孔板中的心肌細胞用胰酶消化后收集，置于－70℃、20min后37℃水浴10min，反復凍融10次，待懸液由渾濁漸變透明后，收集培養基測定SOD活性和MDA水平，實驗操作按照試劑盒說明書進行。

1.5心肌細胞凋亡率的檢測采用流式細胞術。將H9c2細胞按5×105/mL接種6孔板按照上述實驗分組處理，用0.25%胰酶進行消化，PBS洗滌3次后，調整細胞濃度為5×105/mL，分別重懸于200 μL結合緩沖液，加入10 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI室溫避光孵育15min，再加入300 μL結合緩沖液，300目篩網過濾后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6蛋白激酶B(AKT)相關蛋白表達的檢測采用Western blotting法。上述各實驗組處理過的細胞，用預冷的PBS洗滌3次，收集細胞加入裂解緩沖液4℃裂解25min，收集細胞裂解液，離心后收集上清液。BRADFORD法測定裂解液中總蛋白含量。取細胞裂解液上樣于SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠，每孔45 μg蛋白電泳。電轉移將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。加入封閉液封閉1h，再加入抗靶蛋白抗體溶液4℃孵育過夜，洗膜，加入二抗工作液室溫孵育1 h，洗膜，用化學發光試劑盒檢測靶蛋白的表達。結果用Image J軟件分析，計算條帶的吸光度值。采用目的蛋白與內參的比值來表示蛋白表達水平。

2　結果

2.1各組心肌細胞生存率，SOD、LDH活性及MDA水平比較見表1。

表1　各組心肌細胞生存率，SOD、LDH活性及MDA水平比較()

表1　各組心肌細胞生存率，SOD、LDH活性及MDA水平比較()

注:與對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05。

組別　　生存率(%)　LDH(U/L)　MDA(nmol/L)　SOD(U/mL)對照組100　14.83±1.93　3.12±0.32　51.83±4.23模型組　42.72±2.87*　31.43±3.92*　5.62±0.48*　27.98±3.14*苦參堿低劑量組　54.89±3.26#　19.43±1.98#　5.08±2.82#　35.28±3.04#苦參堿高劑量組　68.32±4.83#　24.83±3.87#　4.28±2.82#　41.92±2.86#

2.2各組心肌細胞凋亡率比較對照組、模型組、苦參堿低劑量組、苦參堿高劑量組心肌細胞凋亡率分別為(2.54±0.26)%、(41.54±4.21)%、(25.15 ±2.15)%、(15.42±2.56)%。模型組高于對照組，苦參堿低、高劑量組均高于模型組(P均＜0.05)。

2.3各組心肌細胞中AKT、p-AKT、Bcl-2、Bad、p-Bad、Bax水平比較見表3。

表3　各組心肌細胞中AKT、p-AKT、Bcl-2、Bad、p-Bad、Bax水平比較()

表3　各組心肌細胞中AKT、p-AKT、Bcl-2、Bad、p-Bad、Bax水平比較()

注:與對照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05。

組別AKT　p-AKT　Bcl-2　Bad　p-Bad　Bax對照組　0.93±0.06　0.82±0.07　0.98±0.07　0.82±0.05　0.64±0.06　0.28±0.02模型組　0.90±0.07　0.18±0.02*　0.17±0.01*　0.81±0.06　0.13±0.03*　0.85±0.05*苦參堿低劑量組　0.91±0.06　0.25±0.01﹟　0.28±0.02　0.83±0.07　0.26±0.02﹟　0.43±0.04﹟苦參堿高劑量組　0.90±0.04　0.48±0.03﹟　0.42±0.03　0.82±0.05　0.38±0.01﹟　0.27±0.04﹟

3　討論

氧化應激損傷是機體在遭受各種有害刺激時，體內活性氧過多產生或代謝障礙，超過內源性抗氧化系統對其消除能力時，導致細胞脂質過氧化并引發溶酶體、線粒體損傷的現象［7］。

H2O2是一種重要的ROS來源，是體內氧化代謝的產物，具有較強的氧化能力，可以自由穿過細胞膜和細胞內的鐵離子反應生成活性更強的自由基，引起細胞膜損傷。除此之外，它還能通過脂質過氧化物分解代謝產物MDA，促使蛋白質交聯聚合，并通過多種途徑誘導細胞凋亡［8，9］。

本實驗中H2O2處理細胞后，心肌細胞存活率顯著降低，培養基中LDH活性顯著升高，表明H2O2有顯著的心肌細胞毒性作用，模型建立成功。心肌細胞內MDA水平明顯增高，而SOD活性下降，表明心肌細胞抗氧化自由基損傷的能力下降，細胞發生了氧化應激損傷。用不同濃度氧化苦參堿處理后，心肌細胞存活率較模型組明顯提高，培養基中LDH活性和MDA水平較模型組明顯降低，SOD活性明顯升高，說明氧化苦參堿具有抗氧化應激損傷的作用。

在心肌細胞凋亡的研究中，線粒體凋亡通路是主要途徑，缺血再灌注損傷會導致線粒體凋亡途徑的激活，進而導致細胞色素C釋放，并伴隨著caspase-9的激活而引起細胞凋亡［10］。

AKT是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶。研究表明，AKT處于許多線粒體介導細胞凋亡通路的交匯點，直接或間接地調控細胞凋亡。Bad是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白，能與Bcl-2或Bcl-XL結合形成復合

體。AKT能磷酸化Bad，使Bad從復合物分離，這樣一方面抑制了Bad的促凋亡作用，另一方面有利于解離的Bcl-2和Bcl-XL發揮抗凋亡作用。因此，AKT可以通過p-Bad抑制細胞凋亡。

除此之外，Bad結合Bcl-2，可以使Bcl-2不能結合并抑制促凋亡基因Bax，Bax結合到線粒體膜上，改變線粒體內外膜之間的離子濃度，從而打開線粒體外膜，然后細胞色素C從線粒體中流到細胞質中，與凋亡蛋白水解酶激活因子Apaf-1及caspase-9共同組成凋亡體，接著激活caspase-3，最終誘發細胞凋亡。

本實驗中，我們發現模型組p-AKT、Bad、Bcl-2蛋白的表達較對照組明顯降低，而Bax蛋白表達顯著上升。與模型組比較，苦參堿低、高劑量組p-AKT、Bad、Bcl-2蛋白表達升高，Bax蛋白表達降低。提示氧化苦參堿可以通過p-AKT進而磷酸化下游Bad蛋白，使Bad-Bcl-2-BCL-XL復合物解離，抑制Bax的作用，從而達到抗凋亡的目的，對心肌細胞具有抗氧化應激損傷作用。

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收稿日期:( 2015-06-16)

文章編號:1002-266X(2015)37-0029-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R542.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.37.009