腦動靜脈畸形病變血管組織學變化和血管內皮生長因子的表達*

田　甜，孫雅菲，于　淼，張繼偉，呼鐵民，王維興，王　廣#

1)承德醫學院附屬醫院神經外科 承德 067000　2)河北醫科大學第二醫院神經內科 石家莊 050000

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腦動靜脈畸形病變血管組織學變化和血管內皮生長因子的表達*

田甜1)，孫雅菲2)，于淼1)，張繼偉1)，呼鐵民1)，王維興1)，王廣1)#

1)承德醫學院附屬醫院神經外科 承德 0670002)河北醫科大學第二醫院神經內科 石家莊 050000

關鍵詞腦動靜脈畸形；組織學變化；血管內皮生長因子

摘要目的：探索腦動靜脈畸形(CAVM)與腦血管內皮生長因子(VEGF)之間的關系。方法：對30例CAVM病變血管及病變周圍血管組織標本行HE染色，觀察血管的組織學改變。采用免疫組化法和Western blot法檢測血管中VEGF蛋白的表達，采用熒光定量PCR法檢測血管中VEGF mRNA的表達。以32例正常腦組織血管標本作對照。結果：CAVM病變血管和病變周圍血管較正常腦血管發生明顯改變。熒光定量PCR和Western blot檢測結果顯示，CAVM病變血管和病變周圍血管組織中VEGF mRNA和蛋白表達水平均高于正常腦血管(P均<0.05)，CAVM病變血管中VEGF mRNA和蛋白表達水平高于病變周圍血管(t配對=19.095，3.216，P<0.05)。結論：VEGF可能對CAVM的發生和發展起著重要作用。

AbstractAim: To explore the pathological characteristics of cerebral arteriovenous malformation(CAVM) and the relationship between CAVM and vascular endothelial growth factor(VEGF). Methods: A total of 30 CAVM and the peripheral vascular tissue were collected. Histological changes in vascular tissues were observed using HE staining.The expression of VEGF proteins were detected by immunohistochemistry and Western Blot. The expression of VEGF mRNA were detected by Real-time PCR.32 normal brain vascular tissue were the control. Results: The histological characteristics of CAVM and peripheral vascular tissue were obviously different from the normal brain vascular tissue. The results of Real-time PCR and Western blot showed that the expression of VEGF protein and mRNA in CAVM and peripheral vascular tissue were significantly higher than those in normal brain vascular tissue(P<0.05), and the expression of VEGF protein and mRNA in CAVM were higher than those in peripheral vascular tissue(tmatch=19.095,3.216,P<0.05). Conclusion: VEGF may play an important role in the occurrence and development of CAVM.

腦動靜脈畸形(cerebral arteriovenous malformation，CAVM)為顱內常見血管畸形，占腦血管畸形的93%[1-2]。CAVM是一種進展性疾病，可導致顱內出血、癲癇和慢性神經功能障礙，直至死亡[3-5]。傳統觀點認為，CAVM是由一支或數支迂曲擴張的供血動脈、引流靜脈以及畸形血管病灶組成的、發育異常的腦血管團[6-7]。目前，針對CAVM主要采用顯微外科手術、血管內治療和立體定向放射療法，但臨床效果并不十分滿意。近來的研究[8]認為，CAVM的發生、發展及破裂出血不僅僅是先天性腦血管結構異常，而是先天和后天因素共同作用導致的進行性血管生成和重塑的結果。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可促進血管內皮細胞增殖，誘導血管生成。一般成人腦組織血管基本處于停止生長的狀態，沒有VEGF的表達。但有研究[9]顯示，CAVM患者腦組織存在VEGF表達，有新生血管形成，推測腦組織內VEGF過表達可能與CAVM的發病有關。為探索CAVM的病理學特點，以及CAVM的發病與腦組織內VEGF之間的關系，作者進行了以下實驗。

1資料與方法

1.1一般資料選取 2008年1月至2014年4月在承德醫學院附屬醫院神經外科手術切除的CAVM標本30例，均經手術和病理證實，病灶周圍有足夠腦組織；患者男12例，女18例；年齡21～60歲，平均42.8歲；首發癥狀為腦出血12例，癲癇8例，頭痛6例，局限性神經功能障礙4例。同時選取因腦內血腫腦疝而行顳極切除的正常腦組織血管標本32例；患者男14例，女18例；年齡31～68歲，平均52.8歲。

1.2組織學觀察所有標本經多聚甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋、連續切片后封固，行HE染色，觀察標本組織學改變。

1.3腦組織血管中VEGF蛋白表達的免疫組化法檢測兔抗人VEGF一抗、羊抗兔二抗、SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自Santa Cruz公司。標本4 μm厚切片，常規脫蠟后，60 ℃烤箱過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。采用檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)高壓抗原修復法進行抗原修復，PBS淋洗；滴加過氧化物酶阻斷液，阻斷內源性過氧化物酶活性，室溫孵育10 min；滴加兔抗人VEGF一抗，4 ℃下孵育過夜，PBS淋洗；滴加羊抗兔熒光二抗，室溫孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水；光學顯微鏡下觀察結果。觀察切片中3個高倍(×400)視野，根據陽性細胞百分比和染色強度進行半定量判定。細胞核呈棕黃色染色的為陽性細胞。按陽性細胞所占百分比評分：10%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分。按染色程度評分：淺黃色為1分，黃色為2分，深棕黃色為3分。兩項評分相加，≥2分為陽性，陽性細胞百分比<10%時不論染色強弱均視為陰性。

1.4腦組織血管中VEGF蛋白表達的Western blot法檢測取標本組織置于研缽中研磨；按1 mg加入10 μL的比例加入RIPA裂解液，加入PMSF蛋白酶抑制劑，于離心管中，4 ℃振搖30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min；取上清于-20 ℃保存備用。等量總蛋白上樣，恒壓80 V過濃縮膠，恒壓120 V過分離膠，行電泳分離；恒壓80 V 2 h轉膜至PVDF膜；TBST緩沖液淋洗3×10 min，加入50 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入VEGF一抗，4 ℃孵育過夜；TBST緩沖液淋洗3×10 min，加入抗兔二抗，室溫孵育1 h；TBST緩沖液淋洗3×10 min，凝膠成像儀成像。

1.5腦組織血管中VEGF mRNA的熒光定量PCR法檢測Trizol法提取組織總RNA，逆轉錄成cDNA，行PCR擴增。參照文獻[10]，由上海生工生物工程技術服務有限公司設計并合成引物。VEGF引物上游為5’-GAAGGAGGAGGGCAGAATCATCAC-3’，下游為5’-CACAGGATGGCTTGAAGATGTACTC-3’，產物大小142 bp；GAPDH引物上游為5’-TGG GGAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’，下游為5’-TGA AGGGGTCATTGATGGCAACA-3’，產物大小111 bp。PCR條件：95 ℃預變性3 min，58 ℃退火延伸15 s，共計35個循環，每次延伸時讀取熒光值。運用AB17500 軟件分析溶解曲線，采用2-ΔΔCt值計算VEGF mRNA的表達水平。

1.6統計學處理采用SPSS 17.0進行統計分析。CAVM病變血管和病變周圍血管中VEGF蛋白陽性率的比較采用配對χ2檢驗，VEGF蛋白和mRNA表達水平的比較采用配對t檢驗；CAVM病變血管、病變周圍血管中上述指標與正常腦血管的比較采用χ2檢驗和兩獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。

2結果

2.13組血管的組織學改變HE染色結果表明，CAVM病變血管各層之間排列紊亂，有部分內皮細胞脫落而暴露出內膜下的平滑肌纖維，膠原纖維和平滑肌纖維排列稀疏，參差不齊，血管腔大小不等，管壁厚薄不均，管腔內可見淤血，管腔間可見陳舊性出血和小血腫形成(圖1A)。病變周圍血管有時可見間隙增寬，紅細胞外滲，出現空泡現象，表現出慢性進行性病理改變的過程(圖1B)。正常腦血管各層排列完整有序，血管結構完整(圖1C)。

圖1　組織學變化(HE,×400)

A:CAVM病變血管；B:病變周圍血管；C:正常腦血管。

2.23組血管中VEGF蛋白的表達見圖2。CAVM病變血管內可見VEGF強陽性表達；病變周圍血管也呈現VEGF陽性表達；正常腦血管中VEGF表達呈陰性。CAVM病變血管、病變周圍血管和正常腦血管中VEGF陽性表達率分別為60.00%(18/30)、30.00%(9/30)和6.25%(2/32)。VEGF在CAVM病變血管、病變周圍血管中的陽性表達率顯著高于正常腦血管(χ2=20.772、5.984，P均<0.001)；而CAVM病變血管中VEGF陽性表達率高于病變周圍血管(χ2=5.455，P=0.020)，見表1。

圖2　3組血管中VEGF蛋白的表達(SP，×400)

A:CAVM病變血管；B:病變周圍血管；C:正常腦血管。

2.33組血管中VEGF mRNA和蛋白表達水平的比較檢測結果見表2。CAVM病變血管中VEGF mRNA和蛋白表達水平高于正常腦血管(t=63.090、11.683，P<0.001)；病變周圍血管中VEGF mRNA和蛋白表達水平高于正常腦血管(t=38.181、9.035，P<0.001)；而CAVM病變血管中VEGF mRNA和蛋白表達水平高于病變周圍血管(t配對=19.095和3.216，P<0.001和P=0.003)。

表2　3組血管中VEGF mRNA和蛋白的表達

3討論

CAVM是顱內常見血管畸形，可導致癲癇、慢性神經功能障礙甚至出血死亡，具有很大的危害性。CAVM是進行性血管生成和重塑的結果。臨床上發現CAVM可隨患者年齡增長而增加，提示CAVM的形成與生長可能與血管異常增生和血管新生有關。血管新生包含4個關鍵環節：酶類降解破壞細胞外基質；血管內皮細胞趨化和遷移；血管內皮細胞分裂增殖；血管內皮細胞和外周細胞相互作用[10-11]。由此可見，血管內皮細胞在血管新生過程中起著關鍵作用。在腦血管疾病中常見多種細胞因子參與對血管內皮細胞的調節，如VEGF、胰島素樣生長因子(IGF)、轉化生長因子(TGF-β)和腫瘤抑制因子-α(TNF-α)等[12]。其中VEGF對血管內皮細胞特異性高，能夠與內皮細胞的VEGF-R1、VEGF-R2和VEGF-R3受體結合，使得微小靜脈的通透性增加，并促進血管內皮細胞分裂、增殖以及誘導血管新生，在血管生成的過程中起關鍵作用[13]。在胚胎發育過程中存在VEGF的廣泛表達，對胎兒腦血管的形成和發育起重要作用；正常成年人體內VEGF表達極低，但在腫瘤和糖尿病視網膜病變等某些病理情況下，VEGF的合成分泌會顯著增加[14]。有學者[15]研究發現，VEGF在CAVM患者腦組織內表達上調且伴有新生血管形成，提示腦組織內VEGF過表達可能是誘導CAVM發病的原因。

該研究通過檢測對比CAVM病變血管、病變周圍血管和正常腦血管中VEGF蛋白和mRNA的表達，探索CAVM發病與腦血管內VEGF表達之間的關系。免疫組化和Western blot結果顯示，CAVM病變血管和病變周圍血管內皮細胞VEGF蛋白表達均顯著高于正常腦血管；熒光定量RCR結果顯示，CAVM病變血管和病變周圍血管內皮細胞VEGF mRNA的水平明顯高于正常腦血管；同時該研究發現CAVM病變血管中VEGF蛋白和mRNA表達均高于病變周圍血管。研究結果提示CAVM的發生發展可能與腦血管VEGF的表達水平關系密切。

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*中國衛計委2013中央補助地方煙草監測項目；世界衛生組織項目WPDHP 1408674

Histological changes and expression of VEGF in cerebral arteriovenous malformation vascular tissue

TIANTian1),SUNYafei2),YUMiao1),ZHANGJiwei1),HUTiemin1),WANGWeixing1),WANGGuang1)

1)DepartmentofNeurosurgery,theAffiliatedHospital,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000

2)DepartmentofInternalMedicine,theSecondHospital,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000

Key wordscerebral arteriovenous malformation;histological change;vascular endothelial growth factor

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2015.06.026

中圖分類號R743.4

通信作者#，男，1968年9月生，碩士，副主任醫師，研究方向：腦血管病，E-mail：wangguang@168.com