凝血酶在腦卒中保護作用的研究進展

陳 麗綜述，何曉英審校

（瀘州醫學院附屬醫院神經內科，四川瀘州646000）

凝血酶在腦卒中保護作用的研究進展

陳 麗綜述，何曉英審校

（瀘州醫學院附屬醫院神經內科，四川瀘州646000）

凝血酶；卒中；神經再生；腦/血液供給；綜述

腦卒中是一組突然起病，是以局灶性神經功能缺失為共同特征的急性腦血管疾病，包括腦出血、腦梗死及蛛網膜下腦出血。中國腦卒中發病率排名世界第一，比美國高1倍，腦卒中已成為中國第1位死因。腦卒中除了高致死率外，還具有高致殘率，全國存活的腦卒中患者中有3/4患有不同程度的殘疾，且呈年輕化趨勢，使正值盛年的殘疾人給家庭和社會帶來了巨大的經濟負擔和社會問題。但是腦卒中病理機制復雜，治療效果仍不容樂觀，積極尋找有效措施減輕腦卒中造成的神經功能缺失、降致殘率，是當前神經科學研究的重要課題。

1 凝血酶結構

人體凝血酶由輕鏈A和重鏈B構成，其中A鏈主要作用是穩定凝血酶的整體結構。B鏈結構相對復雜，主要包括以下3個位點。（1）精氨酸側鏈口袋：催化位點，主要由Asp102、His47和Set195構成；（2）非極性結合位點：可與底物發生疏水作用；（3）陰離子結合位點：由B鏈中的6個Lys構成，包括：LysB21、B52、B65、B106、B107、B154，可與血小板受體相互作用，另外B鏈內有3個二硫鍵（Cys42-Cys58、Cys168-Cys182、Cys191-Cys220），具有穩定凝血酶結構的作用。

2 凝血酶生物特性

不管是正常生理還是在病理狀態下，凝血酶都發揮著重要的作用[1]。主要包括：（1）激活凝血因子，促進血小板聚集及加快纖維蛋白的形成；（2）趨化并促進炎性細胞到達損傷部位及分泌炎癥介質，增強NK細胞的溶解及殺傷能力；（3）增強內皮細胞合成能力，加快細胞因子釋放及血管的通透性；（4）促進平滑肌細胞、成纖維細胞、內皮細胞、單核細胞的增殖；（5）可調節神經起源細胞的生長分化及死亡、血管新生、神經保護、影響疼痛信號的傳遞、骨的形成。

3 凝血酶受體（TR）

TR經水解后生成蛋白酶活化受體（PARs），由425個氨基酸構成，為經典的7次穿膜G蛋白偶聯受體，與凝血酶結合后可切斷PAR胞外N-端Arg41-Ser42間的肽鍵，激活G蛋白，從而將信號傳到細胞內，引起細胞變化。在中樞神經系統中，凝血酶受體活化后產生的細胞信號更為廣泛，機制更加復雜。目前，已有4種PAR的cDNA被克隆，PAR1、PAR2、PAR3基因定位于5q13，PAR4基因定位于19p12。在神經系統以PAR1介導細胞信號作用最為顯著[2]。腦卒中后TR被激活，細胞內物質具體包括肌醇1、三磷酸肌醇（IP3）、甘油二酯（DAG）、Ca2+、蛋白磷酸化、腺苷酸環化酶等發生改變，將細胞外信號傳入細胞內，發揮神經保護甚至神經毒性作用[3]。

4 凝血酶在神經中樞的產生、作用特點及清除

腦出血后凝血酶的數量明顯增加，主要由腦出血后血腫組織團塊產生，此外也有一部分來自血液及受損傷的腦組織本身。凝血酶在中樞神經系統具有兩面性，既可加重腦細胞水腫，導致細胞凋亡，又可提高神經細胞耐受能力，免受外界損傷，主要取決于受體的活化率和第二信號的清除之間的比例，低濃度（＜50 nmol/L）活化的凝血酶可不斷失活，不斷降解，使凝血酶還未發揮細胞毒性，就已經被消除。反之，高濃度（≥50 nmol/L）時將加重腦水腫、細胞凋亡、炎性反應及誘發癲癇等神經毒性作用。腦卒中后，受損傷的腦組織缺血、缺氧，新陳代謝減慢，加之腦脊液循環本身就較緩慢，故凝血酶在腦組織中的清除緩慢，其作用效應也將較其他部位延長。

5 凝血酶促進神經突觸可塑性

神經細胞之間信息傳遞功能的特殊接觸部位叫神經突觸，與大腦的神經沖動、學習、記憶有密切關系。腦卒中后神經突觸遭到破壞，凝血酶通過直接或間接激活PAR1，參加突觸傳遞和可塑性恢復。Stein等[4]在急性腦缺血的C57BL/6小鼠中，測得細胞外LTP，指給突觸前纖維一個短暫的高頻刺激后，突觸傳遞效率和強度增加幾倍且能持續數小時至幾天保持這種增強的現象）明顯增強，且N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）也明顯增多，且使用凝血酶抑制劑或PAR1抑制劑可阻礙上述物質的變化。Shimon等[5]在總結凝血酶可通過調節神經突觸可塑性來影響神經功能恢復中，指出凝血酶調節神經突觸是通過激活PAR1來完成的。Becker等[6]研究表明，在去神經的小鼠齒狀顆粒細胞中，通過PAR1激活門冬氨酸受體使突觸可塑性改變。具體機制如下：腦卒中后，凝血酶活性增強，激活PAR1，NMDA通道復合體激活，LTP增強，使突觸傳遞效率增強，加快神經突觸可塑性功能恢復，提高記憶及學習能力。

6 凝血酶促進神經細胞再生

神經元細胞屬于永久性細胞，無再生能力，但Yang等[7]研究發現，存在于腦室下帶、海馬齒狀回、成年哺乳動物的皮質內神經祖細胞存在再生的潛能，并通過實驗證實凝血酶能促進DCX（神經元前體細胞移行過程中表達的一種微管結合蛋白），應用水蛭素后該物質明顯減少。d′Audigier等[8]研究發現，在凝血酶及其受體可刺激內皮前體細胞的分化，促進內皮細胞增殖。Liu等[9]在脊髓損傷模型中，通過免疫印跡分析和免疫組織化學染色方法，證明Ras/Raf/ERK1/2（細胞外信號調節激酶）傳導途徑參加了神經細胞修復。Sayyah等[10]在人類1 321 n1膠質母細胞瘤細胞中，凝血酶可通過激活Rap1/β1整合素傳導途徑，激活下游RhoA介導和磷脂酶D，促進膠質母細胞瘤細胞增殖。凝血酶促進神經細胞再生可能機制：（1）凝血酶通過細胞外調節蛋白使Raf活化形成Ras-GTP，與激活的PKC和Raf共同激活ERK1/2，使細胞核內轉錄因子和（或）P70核蛋白體S6激酶數量增多，促進神經細胞再生。（2）血管內皮生長因子（VEGF）：腦神經細胞再生與血管再生緊密聯系，VEGF為一種特異性內皮細胞絲裂原，凝血酶通過刺激細胞分泌VEGF，為神經細胞再生提供條件。

7 凝血酶促進腦血管再生

血管新生主要指在原有的毛細血管與微靜脈基礎上通過血管內皮細胞的增殖和遷移，從先前存在的血管處以芽生或非芽生（或稱套迭）的形式生成新的毛細血管，主要包括：血管生成因子釋放，細胞外基質（ECM）降解，內皮細胞增殖、遷移和浸潤；血管結構的修整、改建。Tsopanoglou等[11]在雞尿囊絨膜（CAM）系統和基質膠系統證實凝血酶具有促進血管新生。主要通過兩條途徑促進血管新生：（1）凝血非依賴途徑，通過調節細胞因子的表達，如缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）、VEGF、促血管生成素-1（Ang-1）、Ang-2、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9等，促進血管新生；（2）凝血依賴途徑，通過纖維蛋白產生，促進腦血管新生。

7.1 凝血非依賴途徑

7.1.1 凝血酶與HIF-1α HIF-1α在缺血缺氧條件下增多，常氧條件下幾乎不被檢測到，但凝血酶在常氧條件下就能促進血管平滑肌細胞HIF-1α的表達[12]。凝血酶促進血管新生的可能機制是凝血酶受體活化后，通過增加HIF-1α蛋白的翻譯或抑制蛋白降解，使細胞中的HIF-1α蛋白水平升高，也可調節HIF-1α的表達依賴G蛋白偶聯受體（GPCRs）促進血管新生。

7.1.2 凝血酶與VEGF VEGF與其受體（VEGFR-1、VEGFR-2）在血管新生過程中有重要的作用。Wang等[13]將人類臍平滑肌細胞（HUASMC）暴露于凝血酶10 U/mL中，12 d后研究結果顯示，凝血酶顯著增加了HUASMC增殖（n=11，P=0.002）和 VEGF mRNA表達（n=4，P= 0.024）。凝血酶促進VEGF釋放機制：凝血酶與其受體PAR結合活化細胞內p42/p44 MAPK，使轉錄因子SP1 Thr453和Thr739磷酸化，活化的SP1與活化蛋白-2（AP-2）形成轉錄因子復合體，結合于VEGF啟動子（-88、-66）GC富含區，促進VEGF的轉錄，加快血管內皮細胞的形成。最近研究表明，血小板活化后，通過激活PAR1、PAR4，不僅可使VEGF增多促進血管新生，也能增加內皮抑素的釋放抑制血管生成，但VEGF的釋放占主導地位，從而促進血管生成[14]。

7.1.3 凝血酶與Ang-1、Ang-2 Ang-1和Ang-2調節血管形成，主要通過激活或阻礙內皮細胞特異性酪氨酸激酶受體（Tie2）。凝血酶活化后仍可通過激活PAR1使Ang-2基因的轉錄增多，也可促進Ang-1誘導的內皮祖細胞遷移，促進血管生成。凝血因子Ⅹa可以通過不經典的途徑激活PAR3受體，活化Tie2，調節血管生成及穩定血管的完整性[15]。

7.1.4 凝血酶與整合素 整合素αVβ3表達于血管內皮細胞，其表達被認為是內皮細胞血管生成的標志。凝血酶通過增加整合素αVβ3 mRNA轉錄和蛋白表達，使整合素αVβ3明顯增多，加快內皮細胞的黏附、遷移、存活[16]。凝血酶的RGD序列起著不可替代的作用。

7.1.5 凝血酶與MMP MMP在體內主要作用是降解細胞外基質（ECM）。主要通過4個方面促進血管新生：（1）降解血管基底膜及周圍的ECM，使血管新生的出芽和內皮細胞的遷移；（2）釋放調控血管新生的細胞因子；（3）暴露ECM與integrin結合的位點；（4）分離細胞間的黏附。腦卒中后，凝血酶通過增加MMP-1、MMP-2的蛋白表達，使緊密聯系的內皮細胞相互分離且分泌相關細胞因子，增強內皮細胞能力遷移。Machida等[17]發現，腦出血后凝血酶活化后通過PAR1受體使大腦微血管內皮細胞、星形膠質細胞和周細胞釋放MMP9，其中以周細胞釋放最多。

7.2 凝血依賴途徑 此途徑主要研究集中于腫瘤血管新生方面的研究，主要是通過凝血酶裂解纖維蛋白原進而形成纖維蛋白，也可誘導相關因子的釋放，促進血管新生。

7.3 凝血酶與Na+/Ca2+交換體（NCX） Andrikopoulos等[18]發現，在人血管內皮細胞（HUVEC）中，NCX參與凝血酶促進血管新生過程。具體機制：凝血酶活性增強，通過NCX使胞質內Ca2+增多，NADPH氧化酶介導產生活性氧（ROS），進一步促進PAR1及ERK1/2的活化，使用抑制劑SEA0400或NCX1 siRNA均將使ERK1/2的磷酸化減弱，新生血管減少。

8 凝血酶提高神經元耐受能力

8.1 凝血酶提高神經元耐受能力主要表現 低濃度（50 pmol/L～50 nmol/L）凝血酶不僅不會損傷神經細胞，反而可增強神經細胞在低血糖、缺氧、缺血、外界損傷等情況下的耐受能力，使神經細胞存活，保證其正常功能。凝血酶還可以加快神經生長因子的合成及分泌，促進神經細胞損傷的修復，不僅如此，小劑量凝血酶預處理腦出血大鼠后可減輕之后較大劑量凝血酶引起的腦水腫。Wang等[19]將PAR1基因敲除后可明顯加重腦水腫及神經元的死亡及行為障礙。激活內源性蛋白質C使用凝血酶突變W215A/E217A治療缺血性卒中可以提高神經元的存活和減少腦梗死灶，與組織纖溶酶原激活物治療腦梗死相比，可大大減少出血風險[20]。

8.2 凝血酶提高神經元耐受能力可能機制 （1）與凝血酶受體PAR1活化有關，預先激活PAR1，可刺激新蛋白質合成，并與凝血酶受體mRNA的3′端非翻譯區結合，從而產生保護作用；（2）促進熱休克蛋白（heatshock protein，HSP）激活，TPC通路信號轉導途徑，激活HSP 27，使腦細胞耐受性增加，減輕細胞腫脹及減少凋亡，從而保護神經元；（3）PAI-1增多，PAI-1屬于體內凝血酶抑制物，凝血酶促進PAI-1 mRNA增加，及PAI-1蛋白水平的增加，減少由于腦卒中生成大量凝血酶毒性作用，從保護神經細胞免受損害。

近年來，凝血酶的腦保護作用已引起人們的廣泛關注，但其具體機制仍在研究中，能否在凝血酶的神經毒性作用與神經保護作用找到平衡，是作者奮斗的目標。合理地調節凝血酶的水平，盡可能地減少腦損傷，加快腦康復提供理論依據，為臨床治療提供新的觀念和思路。

[1]Archiniegas E，Neves CY，Candelle D，et al.Thrombin and its proteaseactivated receptor-1（PAR1）participate in the endothelial-mesenchymal transdifferentiation process[J].DNA Cell Biol，2004，23（12）：815-825.

[2]Ayala YM，Cantwell AM，Rose T，et al.Molecular mapping of thrombinreceptor interactions[J].Proteins，2001，45（2）：107-116.

[3]Canobbio I，Cipolla L，Guidetti GF，et al.The focal adhesion kinase Pyk2 links Ca2+signaling to Src family kinase activation and protein tyrosine phosphorylation in thrombin-stimulated platelets[J].Biochem，2015-05-13 [2015-05-30].http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=The+focal+ adhesion+kinase+Pyk2+links+Ca2%2B+signaling+to+Src+family+kinase +activation+and+protein+tyrosine+phosphorylation+in+thrombin-stimulated.

[4]Stein ES，Itsekson-Hayosh Z，Aronovich A，et al.Thrombin induces ischemic LTP（iLTP）：implications for synaptic plasticity in the acute phase of ischemic stroke[J].Sci Rep，2015，21（5）：7912.

[5]Shimon BM，Lenz M，Ikenberg B，et al.Thrombin regulation of synaptic transmission and plasticity：implications for health and dise[J].Front Cell Neurosci，2015，21（9）：151.

[6]Becker D，Ikenberg B，Schiener S，et al NMDA-receptor inhibition restores Protease-Activated Receptor 1（PAR1）mediated alterations in homeostatic synaptic plasticity of denervated mouse dentate granule cells[J].Neuropharmacology，2014，86：212-218.

[7]Yang S，Song S，Hua Y，Nakamura T，et al.Effects of thrombin on neurogenesis after intracerebral hemorrhage[J].Stroke，2008，39（7）：2079-2084.

[8]d′Audigier C，Cochain C，Rossi E，et al.Thrombin receptor PAR-1 activation on endothelial progenitor cells enhances chemotaxis-associated genes expression and leukocyte recruitment by a COX-2-dependent mechanism[J].Angiogenesis，2015，18（3）：347-359.

[9]Liu T，Cao FJ，Xu DD，et al.Upregulated Ras/Raf/ERK1/2 signaling pathway：a new hope in the repair of spinal cord injury[J].Neural Regen Res，2015，10（5）：792-796.

[10]Sayyah J，Bartakova A，Nogal N，et al.The Ras-related protein，Rap1A，mediates thrombin-stimulated，integrin-dependent glioblastoma cell proliferation and tumor growth[J].Biol Chem，2014，289（25）：17689-17698.

[11]Tsopanoglou NE，Pipili-Synetos E，Maragoudakis ME，et al.Thrombin promotes angiogenesis by a mechanism independent of fibrin formation[J]. Am J Physiol，1993，264（5 Pt 1）：C1302-1307.

[12]Zhou HJ，Tang T，Cui HJ，et al.Thrombin-triggered angiogenesis in rat brains following experimental intracerebral hemorrhage[J].Neurosurg，2012，117（5）：920-928.

[13]Wang B，Pearson T，Manning G，et al.In vitro study of thrombin on tubule formation and regulators of angiogenesis[J].Clin Appl Thromb Hemost，2010，16（6）：674-678.

[14]Etulain J，Mena HA，Negrotto S，et al.Schattner M Stimulation of PAR-1 or PAR-4 promotes similar pattern of VEGF and endostatin release and pro-angiogenic responses mediated by human platelets[J].Platelets，2015，17：1-6.

[15]Stavenuiter F，Mosnier LO.Noncanonical PAR3 activation by factor Xa identifies a novel pathway for Tie2 activation and stabilization of vascular integrity[J].Blood，2014，124（23）：3480-3489.

[16]Tsopanoglou NE，Andriopoulou，Maragoudakis ME，et al.On the mechanism of thrombin-induced angiogenesis：involvement of alphavbeta3-integrin[J].Am J Physiol Cell Physiol，2002，283（5）：C1501-1510.

[17]Machida T，Takata F，Matsumoto J，et al.Brain pericytes are the most thrombin-sensitive matrix metalloproteinase-9-releasing cell type constituting the blood-brain barrier in vitro[J].Neurosci Lett，2015，599：109-114.

[18]Andrikopoulos P，Kieswich J，Harwood SM，et al.Endothelial angiogenesis and barrier function in response to thrombin requires Ca2+influx through the Na+/Ca2+exchanger[J].Biol Chem，2015-04-14[2015-05-12].http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Endothelial+angiogenesis+and+ barrier+function+in+response+to+thrombin+requires+Ca2%2B+influx+ through+the+Na%2B%2FCa2%2B+exchanger.

[19]Wang J，Jin H，Hua Y，et al.Role of protease-activated receptor-1 in brain injury after experimental global cerebral ischemia[J].Stroke，2012，43（9）：2476-2482.

[20]Berny-Lang MA，Hurst S，Tucker EI，et al.Thrombin mutant W215A/E217A treatment improves neurological outcome and reduces cerebral infarct size in a mouse model of ischemic stroke[J].Stroke，2011，42（6）：1736-1741.

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.16.021

A

1009-5519（2015）16-2468-03

2015-05-04）

陳麗（1989-），女，重慶忠縣人，碩士研究生，主要從事腦血管方向的研究；E-mail：1156506016@qq.com。

何曉英（E-mail：102050228@qq.com）。