去骨瓣減壓對心跳驟停大鼠腦復蘇的影響

馮　凱, 王瑞剛, 趙春香, 張　磊, 石秋艷

(河北聯合大學附屬醫院 NICU, 河北 唐山, 063000)

去骨瓣減壓對心跳驟停大鼠腦復蘇的影響

馮凱, 王瑞剛, 趙春香, 張磊, 石秋艷

(河北聯合大學附屬醫院 NICU, 河北 唐山, 063000)

摘要:目的探討去骨瓣減壓對心跳驟停大鼠腦復蘇的影響。方法選取成年雄性Wistar大鼠48只，隨機分為假手術組(n=16)、對照組(n=16)、去骨瓣干預組(n=16)。每組又分為A(6 h)、B(12 h)、C(24 h)、D(48 h)4個亞組。對照組與去骨瓣干預組采用窒息致大鼠心臟驟停(CA)和心肺復蘇(CPR)模型。去骨瓣干預組在大鼠心肺復蘇成功1 h后行去骨瓣減壓。假手術組僅行氣管插管、股動靜脈置管術。分別于各時間點取血和組織標本，以免疫組化染色法測定的內源性白蛋白滲出的面積百分比來表示BBB的破壞程度，ELISA法檢測血清S100b蛋白質量濃度，TUNEL法檢測細胞凋亡變化，HE染色觀察海馬及大腦皮質細胞大體形態。結果與假手術組比較，對照組及去骨瓣干預組BBB的破壞程度于6 h后開始加重，并持續上升至12 h并達到峰值，之后略有下降，差異具有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，去骨瓣干預組自主循環恢復(ROSC)后12 h顯著降低(P<0.01), 6 h、24 h、48 h亦降低(P<0.05)。與假手術組比較，對照組血清S100b蛋白在ROSC后6 h明顯升高，并持續上升至12 h達峰值, 24 h、48 h有所回落，差異具有統計學意義(P<0.01)。與對照組比較，去骨瓣干預組ROSC后6、12、24、48 h顯著降低(P<0.01)。假手術組僅可見≤3個散在的凋亡細胞出現在皮質。對照組和去骨瓣干預組可見皮質有大量神經元、膠質細胞及部分血管內皮細胞發生凋亡。去骨瓣干預組細胞凋亡數量較對照組明顯減少(P<0.05)。結論去骨瓣減壓能減輕血腦屏障的破壞程度，降低大鼠心肺復蘇后血清中S100b蛋白的表達，減少細胞凋亡，從而減輕腦損傷。

關鍵詞:心肺復蘇; 去骨瓣減壓; 血腦屏障; S100b蛋白; 腦損傷; 細胞凋亡

應用去骨瓣減壓術治療大面積腦梗死已取得了較好的臨床效果。Forsting等[1]在實驗性大腦中動脈閉塞動物模型上均已證實，去骨瓣減壓術可明顯改善動物的神經功能、降低病死率和減少梗死灶體積，但去骨瓣減壓術對窒息性心臟驟停腦保護的作用目前尚未明了。本課題擬在以前研究的基礎上進一步研究去骨瓣減壓術對窒息性心跳驟停大鼠血腦屏障(BBB)、細胞凋亡及S100b蛋白表達的影響，以探討該手術對窒息性心跳驟停大鼠是否有腦保護作用。

1材料與方法

1.1　實驗動物及分組

選取成年清潔級雄性Wistar大鼠48只，體質量280～380 g, 隨機分為假手術組、對照組、去骨瓣組，再將各組按6、12、24、48 h分為4個亞組，每個亞組4只大鼠。實驗前禁食12 h, 不禁水。其中假手術組只行氣管插管和股動靜脈置管術。

1.2　實驗模型制作

參照參考文獻的方法制作改良后的窒息性心跳驟停模型[2,10,11]。腹腔注射9%水合氯醛(0.33 mL/100 g, 河北聯合大學中心實驗室)麻醉，將大鼠固定于手術板上，針狀電極置于皮下，監測心電圖(ECG)。分別行氣管插管和右側股動、靜脈置管術。氣管插管后連接TKR-200C小動物呼吸機，行高頻噴射通氣，吸入空氣，通氣頻率80次/min, 通氣壓力<0.02 mPa。經右股靜脈輸注生理鹽水0.01 mL/(g·h), 股動脈接換能器監測動脈壓及心率穩定10 min。窒息前5 min靜脈注射阿曲庫銨0.1 mg/kg(上海恒瑞醫藥有限公司，批號: 14042722)。夾閉氣管導管直至動態心電監測示心電活動消失，且平均動脈壓<20 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa), 8 min后經右股靜脈插管注入腎上腺素40 μg/kg, 同時開放氣道機械通氣，并給予心外按壓，按壓頻率為200次/min，深度為胸廓前后徑的1/3，動脈波形恢復且MAP>40 mmHg示為按壓有效，自主循環恢復平均動脈壓>60 mmHg, 心率>250次/min示為復蘇成功。死亡或者復蘇時間超過10 min的大鼠剔除本研究。1 h后結扎動靜脈，縫合皮膚，拔出氣管插管，完成窒息性心跳驟停復蘇模型。假手術組動物僅進行麻醉和氣管插管、股動靜脈置管，不進行夾管窒息及CPR。

1.3　去骨瓣干預治療

去骨瓣組大鼠于窒息性心跳驟停復蘇模型成功1 h后，切開頭皮，擦拭分離筋膜，完全暴露另一側頂骨，用顯微牙科鉆在頂骨邊緣上均勻的打孔，配合牙科鑷將大鼠一側頂骨取下, 骨瓣大小約9 mm ×5 mm，放射狀切開硬腦膜，止血、縫合頭皮。

1.4　標本的采集

每亞組大鼠分別于術后6、12、24、48 h后腹腔麻醉，立即開胸暴露心臟，迅速取大鼠上腔動脈血2 mL(待離心)，之后速斷頭取腦，用4%多聚甲醛液固定24 h 后常規脫水、石蠟包埋，每個標本從前聯合開始連續切片3張，切片厚度5 μm, 1張切片用于HE 染色, 1張用于免疫組化染色法測定內源性白蛋白滲出的面積百分比，最后1張用于TUNEL法檢測細胞凋亡變化。將每只大鼠留取的靜脈血離心(3 500 r/min, 10 min), 取上清液于EP管，置于-80 ℃冰箱保存，批量待測。測定血清S100b蛋白濃度，測定步驟嚴格按試劑盒操作說明進行。

1.5　BBB破壞程度[3]

蠟塊切片后脫蠟，用10%小牛血清100 μL室溫封閉30 min, 之后切片置于1%的H2O2中室溫反應20 min, 其中免疫反應一抗為1∶200羊抗大鼠白蛋白抗體( Biodesign, Inc. USA), 二抗為1∶200 辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG (Southern Biotechnology Associates, Inc. USA), 顯色劑為DAB/H2O2。空白對照以0.05 mol/L TBS緩沖液替代一抗，其他步驟不變。BBB破壞范圍的計算方法: 取通過前聯合層面的腦片作為計算BBB破壞的面積，面積用計算機醫用圖像分析系統完成。BBB破壞面積百分率(%)=[(Sc-Si)/Sc]%(Sc正常腦組織面積, Si為對照組或去骨瓣組腦組織面積)[4]。

1.6　細胞凋亡檢測[5]

標本切片常規脫蠟、水化，按TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒提供的實驗步驟進行操作。以細胞核出現棕黃色顆粒為陽性細胞，即凋亡細胞。顯微鏡下陽性細胞計數。

2結果

2.1　各組血腦屏障破壞的程度

與假手術組比較，對照組及去骨瓣干預組BBB的破壞程度于6 h后開始加重，并持續上升至12 h達峰值，差異具有統計學意義(P<0.05); 與對照組比較，去骨瓣干預組ROSC后48 h顯著降低(P<0.01), 6、12、24 h降低(P<0.05)。見表1。

±s)

與假手術組比較，#P<0.05; 與對照組比較，*P<0.05。

2.2　各組大鼠血清S100b蛋白含量變化

與假手術組比較，對照組、去骨瓣組ROSC后6 h起血清S100b蛋白含量明顯升高，并持續上升至12 h達峰值, 24 h有所回落，差異均有統計學意義(P<0.05); 與對照組比較，去骨瓣組ROSC后12、24、48 h顯著降低(P<0.05)。見表2。

μg/L

與假手術組比較，#P<0.05; 與對照組比較，*P<0.05。

2.3　各組大鼠腦細胞凋亡檢測

假手術組僅可見≤3個散在的凋亡細胞出現在皮質。對照組和去骨瓣干預組可見皮質有大量神經元、膠質細胞及部分血管內皮細胞發生凋亡。去骨瓣干預組大鼠不同時點細胞凋亡數量(個)較對照組明顯減少(P<0.05)。見表3。

±s)

與假手術組比較，#P<0.05; 與對照組比較，*P<0.05。

2.4　HE染色觀察組織結構及細胞形態結構比較

對照組：大腦皮層及海馬可見不同程度的神經元細胞損傷表現。心肺復蘇后6 h組：可見大腦皮層及海馬區神經元細胞輕度水腫，部分細分細胞核濃染，固縮。心肺復蘇后12 h組：神經元細胞水腫加重，神經氈疏松，大量細胞核濃染，固縮，局部可見少量三種深染單核淋巴細胞浸潤。心肺復蘇后24 h組：神經元壞死明顯，細胞數量減少，呈空泡狀，剩余的細胞大部分固縮深染，核仁消失，部分細胞核碎裂、細胞核固縮深染，核仁消失，部分細胞溶解，甚至消失，腦質細胞增生。心肺復蘇后48 h組：神經細胞失去完整的結構狀態，明顯出現核碎裂，細胞周圍高度水腫，可見大量膠質細胞增生。

去骨瓣組：6 h較對照組未見明顯變化，12、24、48 h后大腦皮層及海馬可見神經元細胞壞死減少，膠質細胞增生，大量新生毛細血管。

假手術組：神經細胞數量及形態結構分布正常，未見神經元病理性損傷。

3討論

腦缺血導致BBB通透性增加，表現為血漿蛋白等物質通過開放的BBB滲漏到損害區[9,15]。研究[6-7]發現，自腦缺血后6 h始即可檢測到白蛋白( BBB 開放)，一般于缺血后48～72 h 達高峰，以后逐漸下降。通過直接或經標記后測定滲出的物質, 可以用來分析BBB破壞的程度和范圍。本研究發現在心肺復蘇成功后48 h, 去骨瓣減壓組能明顯縮小白蛋白滲出的范圍(P<0.05)。去骨瓣減壓術增加了腦血流量，改善微循環，改善全腦的血液供應，同時也使該區域的血管本身得到血供，使血管內皮細胞免受缺血性損害, BBB破壞范圍縮小。

S100b蛋白主要分布于中樞神經系統、外周神經系統的神經膠質細胞和施萬細胞[8]。生理量的Sl00b蛋白作為鈣傳感器具有廣泛的生物學活性，調節細胞的能量代謝，作為細胞內正常成分參與細胞內外鈣離子水平的調節，促進神經的生長和損傷的修復[12]。但高濃度S100b蛋白對神經元具有毒性作用，升高神經元細胞內鈣離子濃度，導致胞內鈣超載，誘導神經元凋亡或壞死[13-14], 而神經元的死亡又可引發小膠質細胞活化和白細胞介素-1的分泌，后者上調星形膠質細胞表達S100b蛋白，形成一個正反饋環路，加重神經元凋亡或壞死[15]。S100b蛋白過量表達將增加大腦對缺血缺氧損傷易感性，與急性腦損傷直接相關。腦損傷時神經膠質細胞S100b蛋白表達的增加，導致腦脊液和血液S100b蛋白水平的升高。動物實驗和臨床研究表明，腦創傷后腦脊液和血清中S100b蛋白含量升高，升高程度與腦損傷程度及預后有相關性。本研究結果顯示，去骨瓣減壓術后，伴隨S100b蛋白表達降低的同時，大腦皮質細胞凋亡數量也明顯降低。因此，去骨瓣減壓術可能通過改善腦組織血供，減少細胞凋亡，對腦組織起到保護作用。

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Effect of decompressive craniectomy on cerebral

resuscitation of cardiac arrest rats

FENG Kai, WANG Ruigang, ZHAO Chunxiang, ZHANG Lei, SHI Qiuyan

(NICU,AffiliatedHospitalofHebeiUnionUniversity,Tangshan,Hebei, 063000)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the effect of decompressive craniectomy on cerebral resuscitation of cardiac arrest rats. MethodsA total of 48 adult male Wistar rats were randomly divided into sham-operation group (n=16), control group (n=16) and craniectomy intervention group (n=16). Each group was further divided into four subgroups of A (6 h), B (12 h), C (24 h), and D (48 h). The control group and craniectomy intervention group adopt rat cardiac arrest (CA) and cardiopulmonary resuscitation (CPR) model caused by suffocation. Rats in the craniectomy intervention group operated decompressive craniectomy after 1 h of successfully cardiopulmonary resuscitation (CPR). The sham-operated group only had endotracheal intubation and femoral arteriovenous catheter. The blood and tissue samples were collected respectively at each time point, immune-histochemical staining method was used to detect the endogenous albumin leakage area percentage which showed the BBB damage, ELISA method was applied to detect the serum S100b protein mass concentration, and TUNEL method was applied to detect the change of apoptosis, and HE staining was to observe the hippocampus and cerebral cortex cells form. ResultsCompared with the sham-operation group, BBB damage degree aggravated 6 h later in the control group and the decompressive intervention group，raised until the point of 12 h and reached the peak, then it was slightly down, the difference was statistically significant (P<0.05). Compared with the control group, the decom pressive intervention group′s spontaneous circulation recovery (ROSC) significantly decreased 12 h later (P<0.01), 6 h, 24 h and 48 h also decreased (P<0.05). Compared with the control group, control group′s serum S100b protein in ROSC significantly increased 6 h later, raised to the peak at 12 h, and declined in 24 h and 48 h, there was statistically significant difference (P<0.01). Compared with the control group, the decompressive intervention group decreased significantly after ROSC at 6, 12, 24 h and 48 h (P<0.01). There were only less than 3 scattered apoptotic cells seen in cortex in the sham-operated group. A large number of neurons, glial cells and part of the vascular endothelial cell apoptosis were available in cortex in the control group and the decompressive intervention group. The number of cell apoptosis in the decompressive intervention group decreased significantly than that of the control group (P<0.05). ConclusionThe decompressive craniectomy can reduce the damage rate of the blood brain barrier, decrease S100b protein expression in serum after cardiopulmonary resuscitation (CPR) in rats, and reduce the apoptosis so as to reduce the brain damage.

KEYWORDS:cardiopulmonary resuscitation; decompressive craniectomy; blood-brain barrier; S100b protein; brain damage; cell apoptosis

通信作者:王瑞剛

基金項目:河北省衛計委指令性課題(ZL20140143)

收稿日期:2015-03-02

中圖分類號:R 541.7

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)11-005-04

DOI:10.7619/jcmp.201511002