轉染VEGF基因對內皮祖細胞生長的影響研究

王　偉，劉德紅，李卓成，羅　蓉，許長瓊，楊自華

(1.深圳市第二人民醫院 檢驗科，廣東 深圳518035；2.深圳市人民醫院 檢驗科，廣東 深圳518020)

轉染VEGF基因對內皮祖細胞生長的影響研究

王偉1，劉德紅1，李卓成1，羅蓉1，許長瓊1，楊自華2*

(1.深圳市第二人民醫院 檢驗科，廣東 深圳518035；2.深圳市人民醫院 檢驗科，廣東 深圳518020)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0355)

血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)是近年來發現的一類在血管新生過程中起重要作用的前體細胞，具有干細胞的特性，可以不斷增殖，并可分化為成熟血管內皮細胞[1]。EPCs在修復損傷的血管內皮方面具有極其廣泛的應用價值，在心腦血管疾病[2]、缺血組織內新生血管形成[3]等方面EPCs已展示出強大的應用潛能，但來源短缺、數量稀少一直是EPCs廣泛應用的一個限制因素。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一類具有強烈促進血管內皮細胞生長和分化功能的細胞因子，是EPCs增殖和定向分化不可或缺的要素之一，可以增強內皮祖細胞修復血管內皮的能力[4]。本研究通過腺病毒包裝VEGF165基因轉染入大鼠骨髓來源EPCs，觀查轉染效率及對EPCs增殖的影響，為后續實驗奠定研究基礎。

1材料和方法

1.1材料

DMEM細胞培養基、胎牛血清、胰酶購自Gibco公司；Ficoll密度梯度淋巴細胞分離液購自Sigma公司；VEGF購自Peprotech公司；二甲基亞楓(DMSO)、四唑藍(MTT)細胞增殖檢測試劑盒購自北京晶美生物制品有限公司；DiI-Ac-LDL購自Molecular probes公司，FITC-UEA-Ⅰ購自Sigma公司； ELISA檢測VEGF試劑盒購自上海森雄有限公司。

1.2方法

1.2.1內皮祖細胞的分離和誘導大鼠經頸椎脫臼法處死后，無菌分離股骨，用消毒針頭在股骨兩端各穿小孔，用DMEM培養液沖洗骨髓，篩網過濾去除結締組織塊，過濾液緩慢疊加至大鼠淋巴細胞分離液上，2 000 r/min離心20 min，分離出中間白色的單個核細胞層。PBS洗滌3次后細胞計數，并重懸于內皮祖細胞專用培養液中(含15%胎牛血清，終濃度50 ng/ml的VEGF及100 U/ml的青霉素的低糖DMEM培養液)。按5×105/孔的密度接種于預先鋪有纖維連接蛋白的24孔細胞培養板，置于37℃ 5% CO2細胞培養箱培養4天后換液棄去未貼壁細胞，繼續培養7天備用。

1.2.2內皮祖細胞的鑒定誘導后的內皮祖細胞進行細胞爬片24 h后，在含有DiI-Ac-LDL(2.4 μg/ml)的無血清DMEM培養基中于37℃孵育培養2 h；PBS漂洗3次，2%多聚甲醛固定10 min；PBS漂洗3次，滴加FITC-UEA-Ⅰ(10 μg/ml)并于37℃溫箱孵育2 h，最后用熒光顯微鏡觀察染色情況。

1.2.3VEGF165轉染內皮祖細胞轉染分三組：VEGF轉染組、空載轉染組及未轉染對照組。其中VEGF組轉染不同滴度的攜帶有VEGF的病毒，空載轉染組轉染空病毒載體，未轉染對照組為不作任何轉染操作的內皮祖細胞。VEGF165腺病毒重組質粒(Adv-GFP-VEGF)的構建由北京諾賽基因組研究中心完成，病毒滴度為1010/ml，稀釋成106/ml備用。胰酶消化內皮祖細胞后計數；按照每孔105個細胞的密度種6孔板，按細胞病毒比1∶10、1∶50和1∶100加入不同滴度的重組腺病毒，于37℃、5% CO2細胞培養箱培養2 h；每孔加入3 ml內皮祖細胞專用培養基，繼續在37℃ 5% CO2細胞培養箱培養24 h，置熒光顯微鏡下觀察轉染效果，細胞呈綠色表示質粒轉染成功。

1.2.4采用MTT法檢測VEGF165轉染后內皮祖細胞增殖情況按照前述方法，以1∶50的比例將VEGF165質粒及空載體轉染入內皮祖細胞，待細胞進入對數生長期，胰酶消化細胞，PBS洗滌后重懸于內皮祖細胞專用培養基；臺盼藍染色后進行細胞計數；按每孔5×103個細胞的密度種植96孔板，在37℃ 5% CO2條件下培養，培養液中VEGF含量減半，每3-4天更換細胞培養液；第2、4、6、8、10、12、14天時加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，培養4 h；吸棄上清液后，加100 μl DMSO孵育10 min，用分光光度計讀取570 nm波長處的吸光度值。

1.2.5采用ELISA法檢測VEGF165轉染后內皮祖細胞分泌VEGF水平VEGF165質粒轉染后第2、4、6、12天取上清液檢測VEGF含量，操作嚴格按照說明書進行。通過試劑盒所帶標準品，繪制標準曲線，計算各時間點上清液中的VEGF含量。

2結果

2.1內皮祖細胞的形態觀察及鑒定

新鮮分離的骨髓內皮祖細胞呈圓形，形態飽滿，折光性好；培養2天后的內皮祖細胞開始貼壁，形態開始變為短梭狀；3天后開始增殖，體積增大。用FITC-UEA-I和Dil-Ac-LDL雙染色法鑒定分化中的內皮祖細胞，結果如圖1，表明內皮祖細胞分化良好。

2.2VEGF165轉染內皮祖細胞效率驗證

由于轉染質粒中帶有綠色熒光蛋白，因此，轉染VEGF165成功的細胞在熒光顯微鏡下會呈現綠色。圖2為不同比例的病毒質粒轉染內皮祖細胞的結果：細胞病毒比為1∶100的轉染會造成細胞狀態不佳，甚至死亡，而細胞病毒比為1∶10的轉染成功率略差，而細胞病毒比1：50的轉染不僅轉染效率高(幾近100%)，而且轉染后細胞狀態好，增殖不受影響。因此，后續實驗皆以細胞病毒比1∶50進行轉染。

2.3VEGF165轉染后內皮祖細胞分泌VEGF含量測定

按照細胞病毒比1∶50將克隆有VEGF165的腺病毒質粒轉染內皮祖細胞，采用ELISA方法檢測細胞培養上清中VEGF含量，結果顯示，與未轉染或轉染空載體的細胞相比，VEGF轉染的內皮祖細胞可以分泌大量VEGF，使得細胞培養上清中VEGF含量明顯高于未轉染組和空載轉染組，在轉染后的各個時間點，差異均具有統計學意義(表1)。

圖1　內皮祖細胞形態觀察及鑒定

圖2　VEGF165轉染內皮祖細胞效率鑒定

組別轉染天數(天)24612VEGF轉染組4.96±0.535.67±0.644.75±0.574.24±0.46空載轉染組3.23±0.34**3.16±0.31**3.05±0.28**2.78±0.32**未轉染組3.15±0.31**2.98±0.37**2.94±0.33**2.87±0.29**

注：**表示與VEGF轉染組相比，P<0.01

2.4VEGF165轉染后內皮祖細胞的增殖測定

按照細胞病毒比1∶50將克隆有VEGF165的腺病毒質粒轉染內皮祖細胞，采用MTT法測定轉染后細胞的增殖情況。結果顯示，空載轉染并不影響細胞的增殖情況，而轉染VEGF165后，細胞在第6天開始顯現更強的增殖能力，第10天開始增殖能力具有統計學差異(見圖3)。

3討論

對受損血管結構和功能的修復是治療腦血管、心血管等血管破壞性疾病的關鍵環節。機體在生理條件下，當血管內皮受損時，釋放的炎癥介質及趨化因子可以動員骨髓EPCs、招募血液中少量EPCs聚集在受損血管周圍，在局部微環境下增殖、分化成為成熟的血管內皮細胞，對受損血管進行修復[5]。

圖3　MTT法檢測VEGF165轉染內皮祖細胞后的細胞

EPCs存在于臍帶血、骨髓中及外周血中，外周血的EPCs含量極低，臍帶血則較難獲得，因此，骨髓是研究EPCs最常用的來源。骨髓來源的單個核細胞在體外經過適當培養，可分化為具有較強增殖能力的EPCs[6]。本研究通過分離大鼠脛骨骨髓中單個核細胞，用EPCs專用培養液進行誘導培養，去除不貼壁細胞，從而獲得較純EPCs。經過FITC-UEA-I及Dil-Ac-LDL雙染色鑒定，發現這些細胞具有內皮細胞定向分化的能力。

VEGF在EPCs增殖及定向分化過程中扮演重要角色，人類的VEGF基因定位于6p21.3，基因產物為一種糖蛋白，由分子質量為17000～22000的亞基組成同源二聚體[7]。根據分子量大小，人類的VEGF分為5種，其氨基酸數目分別為121、145、165、189及206個，其中VEGF165的生物學活性最強[8]。VEGF通過與EPCs上的受體特異性結合后，活化受體胞內段偶聯的酪氨酸激酶，進而催化下游的信號蛋白，誘導EPCs的增殖和向內皮細胞分化[9]。介于VEGF強大的促EPCs增殖能力，我們將VEGF165轉染至EPCs，讓EPCs自分泌VEGF，以期EPCs具有更快的增殖能力和分化潛能。由于腺病毒載體內自帶有綠色熒光蛋白基因，因此轉染成功的細胞會顯示自發綠色熒光，便于檢測轉染效果和細胞示蹤。為獲得最好的轉染效果，我們根據文獻[10]設計不同梯度的細胞病毒比，發現當細胞病毒比為1∶50時，轉染效率最高，幾乎達到100%，且細胞狀態良好。降低細胞病毒比(如1∶10)時轉染效率會隨之降低，而增大細胞病毒比(如1∶100)會引起細胞的死亡，轉染入細胞的蛋白基因只有表達之后才能發揮其生物活性，ELISA法檢測培養上清中的VEGF含量，發現轉染第二天，細胞培養上清中的VEGF含量就明顯增加，顯示了腺病毒載體作為轉染工具的高效性[11]，且在檢測的各個時間點，實驗組的VEGF含量均高于對照組。而未轉染組及空載體轉染組檢測到的VEGF水平，是培養基中添加的外源VEGF，為保持EPCs的生長所必須。為檢測VEGF165轉染的EPCs自分泌的VEGF對生長的影響，本研究用MTT法檢測轉染后各組細胞增殖能力，結果顯示腺病毒空載轉染的細胞與未轉染質粒的細胞生長速度一致，說明腺病毒載體不影響EPCs的生長；而VEGF165轉染的EPCs增殖能力顯著高于對照組，說明其自身分泌的VEGF可以促進自身的增殖。該結果與曾慶娟等[12]報道的結果一致，但與王盛等[10]報道的結果不相符，可能跟實驗體系中培養EPCs所用培養液中VEGF含量有關，我們在檢測細胞增殖的實驗中降低培養體系的VEGF含量，避免培養基中的過于足量的VEGF使得EPCs的增殖能力達到飽和，這樣便于檢測轉染VEGF165后細胞分泌的VEGF的生物學功能。

總之，本研究通過腺病毒載體重組VEGF165轉染EPCs，成功地建立了高轉染率的方法體系，轉染VEGF165基因的EPCs可以分泌高水平的VEGF，并展現出良好的增殖潛能，為后續EPCs的體內試驗研究奠定了良好基礎。

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[12]曾慶娟,尤捷,許崇永,等.人VEGF165基因轉染兔骨髓內皮祖細胞及對其增殖的影響[J].浙江醫學,2009,31(7):927.

112197)

摘要：目的探討血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因轉染大鼠內皮祖細胞的方法，分析轉染VEGF基因對內皮祖細胞生長的影響。方法分離大鼠骨髓內皮祖細胞并誘導其分化，采取FITC-UEA-I 和Dil-Ac-LDL雙染色法驗證；采用腺病毒包裝VEGF165基因，按照不同比例轉染內皮祖細胞后，通過熒光顯微鏡觀察質粒自帶綠色熒光蛋白驗證轉染效率；以未轉染及轉染空載體為對照；采用MTT法驗證轉染VEGF165基因對內皮祖細胞增殖的影響；采用ELISA法檢測轉染后細胞培養上清中的VEGF含量。結果分離誘導的大鼠內皮祖細胞分化良好，FITC-UEA-I及Dil-Ac-LDL均呈陽性；按照細胞病毒比1：50轉染內皮祖細胞的轉染效率最高，且細胞狀態不受影響；轉染VEGF165基因的內皮祖細胞能分泌大量的VEGF，提高培養上清液中的總VEGF水平，其增殖能力也明顯強于空質粒轉染組和未轉染組。結論通過腺病毒載體轉染VEGF165基因可以促進內皮祖細胞分泌VEGF，提高內皮祖細胞的增殖能力。

關鍵詞：血管內皮生長因子；腺病毒；轉染；內皮祖細胞

Experimental study of rat endothelial progenitor cells transfected with VEGF 165 geneWANGWei,LIUDe-hong,LIZhuo-cheng,etal.(ClinicalLaboratoryoftheSecondPeople'sHospitalofShenzhencity,Shenzhen518035,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the methodology of transfecting vascular endothelial growth factor (VEGF) gene to endothelial progenitor cells and detect the effect of VEGF transfection to endothelial progenitor cells.MethodsMononuclear cells from rat bone marrow were separated and induced for differentiation,and double staining of FITC-UEA-I and Dil-Ac-LDL was used to characterize the induced endothelial progenitor cells.VEGF165 gene was incorporated into adenovirus and transfected into endothelial progenitor cells according to different cell virus ratio,the green fluorescence protein was used as readout to detect the efficiency of transfection.Theproliferation of VEGF transfected endothelial progenitor cells was detected by MTT colorimetric assay,and the VEGF in the supernatant of culturing cells was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsThe endothelial progenitor cells were well induced and differentiated,both positive for FITC-UEA-I and Dil-Ac-LDL staining.Transfection using 1:50 as cell virus ratio showed the fittest efficiency and survival rate.Transfected endothelial progenitor cells secreted VEGF and up-regulated the level of VEGF in the supernatant,and the cells transfected with VEGF showed superior capacity of proliferation than vector transfected cells or non-transfected cells.ConclusionVEGF165 gene transfected endothelial progenitor cells could self-secrete VEGF and thus showed superior capacity of proliferation.

Key words:vascular endothelial growth factor; adenovirus; transfection; endothelial progenitor cell

收稿日期：(2014-03-23)

作者簡介：王偉(1974-)，男，碩士研究生，副主任技師，主要從事主要從事心血管疾病炎性機制的研究。

文獻標識碼：A

中圖分類號：Q78

文章編號：1007-4287(2015)03-0355-04

通訊作者*

基金項目：深圳市科委知識創新計劃項目(JCYJ20130401104