二甲雙胍在不同葡萄糖濃度下對小鼠黑色素瘤細胞B16增殖的影響

李亞平，孫　月，夏美慧，馬麗偉，謝　奇，駱偉麟，于慧美*

(1.吉林省人民醫院 皮膚科，吉林 長春130021；2.吉林大學基礎醫學院；3.吉林大學第一醫院 婦產科)

二甲雙胍在不同葡萄糖濃度下對小鼠黑色素瘤細胞B16增殖的影響

李亞平1，孫月2，夏美慧3，馬麗偉2，謝奇2，駱偉麟2，于慧美2*

(1.吉林省人民醫院 皮膚科，吉林 長春130021；2.吉林大學基礎醫學院；3.吉林大學第一醫院 婦產科)

(ChinJLabDiagn,2015,19:0536)

黑色素瘤常見于中老年人，男性多發于女性，常見于下肢、足部、軀干、頭頸部和上肢，癥狀主要表現為迅速增大的黑色素結節[1]。近年來，腫瘤與代謝性疾病之間的關系逐漸成為研究的熱點。二甲雙胍是臨床廣泛應用的降糖藥物，用于II型糖尿病的治療，其降血糖效果和安全性得到普遍認可[2]。近年來的研究認為，該藥物在調節機體糖類代謝的同時，還具有一定程度的抑制腫瘤細胞生長的作用。研究顯示，體內胰島素水平能促進腫瘤細胞生長并影響腫瘤的預后，而二甲雙胍與其他降糖藥相比更能降低糖尿病患者腫瘤的發生率[3]。目前，關于二甲雙胍與腫瘤的研究多針對于肺癌等，且機制尚未明確[3,4]。缺乏關于二甲雙胍及葡萄糖缺乏對黑色素瘤的研究。本研究通過分析二甲雙胍在不同糖條件下對小鼠黑色素瘤細胞B16形態、細胞生存率、凋亡及線粒體膜電位的影響，為今后的研究提供一定的理論基礎。

1材料與方法

1.1　試劑與細胞

小鼠黑色素瘤細胞B16購自中國科學院上海細胞生物學研究所，胎牛血清購自美國Clark公司，RPMI-1640培養基購自美國Uibco公司，MTT購自美國Sigma公司，Hoechst33342染料購自碧云天生物技術研究所，Annexin V-PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司。B16細胞株用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養液在37℃，5% CO2的孵箱內孵育培養，以0.4 %胰酶消化傳代，隔2 d傳代1次，取對數生長期細胞分組進行實驗。

1.2　方法

1.2.1實驗分組細胞隨機分組，分別加入不同濃度的葡萄糖(25 mM、4 mM、3 mM、2 mM、1 mM)，分別選擇葡萄糖高劑量組(25 mM)合加二甲雙胍(0、10 mM、20 mM、40 mM)，葡萄糖低劑量組(1 mM)合加二甲雙胍(0、10 mM、20 mM、40 mM)。

1.2.2MTT法檢測細胞存活率B16細胞消化離心后，按1×104個/孔接種于96孔板，37℃，5% CO2培養箱中培養20-24 h，使細胞達到對數生長期。待細胞融合度達到80%左右，設立對照組以及不同濃度葡萄糖及二甲雙胍組，每個濃度6個重復孔，CO2培養箱中作用24 h后每孔加入20 μl MTT，繼續孵育4 h，棄掉孔板中的培養液，每孔加150 μl二甲基亞礬(DMSO)，孔板振蕩器振蕩15 min，充分溶解結晶物。在BIO TEK酶標儀上，選擇490 nm波長，測定96孔板各孔光吸收值，記錄結果，計算細胞存活率。對照組細胞存活率為100%，其余各組存活率=(各濃度組A值/對照組A值)×100%。

1.2.3Annexin V-PI檢測細胞凋亡率B16細胞按1×107個/孔接種于培養瓶中，置于37℃，5% CO2的恒溫二氧化碳細胞培養箱中培養20-24 h。待細胞達到80%左右融合時，加入不同濃度葡萄糖及二甲雙胍，繼續培養24 h。棄掉培養液，PBS洗滌2-3次，按凱基Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，先加入Annexin V，混勻后再加入PI，混勻后，利用流式細胞儀分析各組細胞的凋亡率。

1.2.4Western blot檢測Cyt C表達水平蛋白濃度按試劑盒說明書操作。酶標儀測量630 nm不同孔OD值，繪制標準曲線從而計算出各組樣本蛋白濃度。利用加樣器向加樣孔中緩慢加入蛋白樣本。轉膜結束后將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中封閉1-2 h。封閉結束后用PEST洗PVDF膜3次，每次5 min，倒掉PEST將PVDF膜放人自封袋中加入Cyt C一抗，4℃冰箱中過夜。回收一抗，PEST洗膜3次，加入二抗(1∶1 000比例)，室溫1 h。回收二抗，PEST洗膜3次，DAB顯色液顯色，當看到目標帶后將膜放人蒸餾水內中止顯色。拍照后封存，灰度值掃描分析。

1.3　統計學方法

本實驗數據分析采用SPSS16.0版統計軟件進行處理。

2結果

2.1　葡萄糖對B16細胞存活率的影響

B16細胞接種于96孔板后培養過夜，加入含有不同濃度葡萄糖的1640培養液及血清繼續培養24 h，采用MTT法檢測不同濃度葡萄糖對B16細胞存活率的影響。與對照組(25 mM)相比，葡萄糖濃度4 mM、3 mM、2 mM、1 mM時細胞生存率分別為(74.57±2.52)%、(63.29±4.36)%、(61.61±2.33)%和(56.54±1.56)%，均隨著葡萄糖濃度的降低而降低，且呈劑量依賴性(圖1)。

2.2　葡萄糖對B16細胞形態的影響

利用倒置顯微鏡觀察不同葡萄糖濃度對B16細胞形態的影響。顯微鏡下可以觀察到，在25 mM葡萄糖濃度下，B16細胞形態飽滿，呈多角形，隨著葡萄糖濃度的降低，細胞形態逐漸變的皺縮細長，尤其是在1 mM葡萄糖條件下，與25 mM葡萄糖相比，視野中細胞數量顯著減少，細胞變小，形狀更加細長(圖2)。

2.3　二甲雙胍在不同葡萄糖濃度下對B16細胞存活率的影響

分別采用25 mM和1 mM葡萄糖與不同濃度二甲雙胍聯合作用B16細胞24 h，比較不同葡萄糖條件下二甲雙胍對B16細胞存活率的影響。MTT結果顯示，不同葡萄糖條件下，二甲雙胍都能抑制B16細胞的增殖率(圖3)。

圖1不同葡萄糖濃度對小鼠黑色素瘤

細胞B16生存率的影響

A:25 mM葡萄糖B:4 mM葡萄糖C:2 mM葡萄糖D:1 mM葡萄糖

圖2不同葡萄糖濃度對小鼠黑色素瘤

細胞B16形態的影響

圖3　不同二甲雙胍濃度對小鼠黑色素瘤

2.4　二甲雙胍在不同葡萄糖濃度下對B16細胞凋亡的影響

分別采用25 mM及1 mM葡萄糖聯合10 mM二甲雙胍作用細胞24 h，Annexin V-PI 檢測B16細胞細胞凋亡率。實驗結果顯示，與對照組即25 mM葡萄糖組(2.62±2.89)%相比，1 mM葡萄糖組細胞凋亡率為(44.15±2.29)%，25 mM葡萄糖+10 mM二甲雙胍組細胞凋亡率為(22.18±3.72)%，1 mM葡萄糖+10 mM二甲雙胍凋亡率為(61.54±2.84)%,凋亡率最高(圖4)。

圖4　Annexin V-PI 檢測觀察B16細胞凋亡率

2.5　二甲雙胍在不同葡萄糖濃度下對B16細胞Cyt C表達的影響

分別采用25 mM及1 mM葡萄糖聯合10 mM二甲雙胍作用細胞24 h，Western blot方法檢測B16細胞Cyt C的表達水平。結果顯示，與對照組即25 mM葡萄糖組相比，1 mM葡萄糖組Cyt C表達水平略有上調。25 mM葡萄糖+10 mM二甲雙胍組Cyt C無明顯變化，1 mM葡萄糖+10 mM二甲雙胍組Cyt C表達水平顯著上調(圖5)。

3討論

黑色素瘤是由異常黑素細胞過度增生引發的常見的皮膚腫瘤，惡性程度非常高，是皮膚腫瘤致死的主要原因之一[5]。主要多發生于皮膚或接近皮膚的黏膜，其發病率隨人種、地域、種族的不同而有所差異，白種人的發病率遠較黑種人高[6]，我國雖屬黑色素瘤的低發區，但近年來發病率卻呈不斷上升趨勢，逐漸引起醫療工作者的關注[7]。本研究首先探討了葡萄糖對B16細胞生存率的影響。研究結果顯示葡萄糖能夠抑制B16細胞的增殖，并呈現劑量依賴性，隨著葡萄糖濃度的降低，B16細胞增殖率顯著降低。這說明葡萄糖是B16細胞生存所必需。這為從糖饑餓角度治療黑色素瘤提供理論基礎。

圖5　Western blot檢測B16細胞Cyt C表達水平

二甲雙胍作為經典的治療糖尿病的藥物，其在臨床上的應用價值正不斷得到發掘。近年來，研究者發現，二甲雙胍除了能夠改善2型糖尿病患者的血糖控制外，還潛在地降低某些癌癥發病風險，并有可能改善某些合并癌癥2型糖尿病患者的預后。越來越多從流行病學到臨床研究等方面為二甲雙胍的抗腫瘤作用提供證據。其可能的抗腫瘤作用機制包括以下方面：①改善高血糖和高胰島素血癥狀態[8]；②抑制細胞線粒體的電子轉移，抑制氧化磷酸化，導致細胞凋亡[9]；③激活AMP 激活蛋白激酶(AMPK)，抑制哺乳動物的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)[10]。④通過抑制CyclinD1表達而糾正AGEs 誘導的細胞周期紊亂[11]。本研究結果顯示，無論在正常葡萄糖濃度(25 mM)還是低糖(1 mM)濃度下，二甲雙胍均可以顯著抑制B16細胞增殖率，這可能是由于二甲雙胍抑制了B16細胞對葡萄糖的攝取。

線粒體細胞色素C具有調控細胞能量代謝和凋亡的雙重功能，它既通過對細胞能量代謝的調節，

調控細胞死亡方式；又能通過對凋亡信號的傳導和放大作用，直接介導細胞凋亡。本實驗結果顯示無論是低糖條件還是聯合二甲雙胍均能促進Cyt C的表達，這也從另一方面提示二甲雙胍可能通過抑制葡萄糖吸收在調控細胞能量代謝過程中發揮作用。

綜合以上結果顯示，二甲雙胍在不同葡萄糖濃度下通過細胞凋亡的方式引起小鼠黑色素瘤細胞B16生存率下降，而二甲雙胍可能通過抑制葡萄糖攝取，促進細胞線粒體細胞色素C釋放引起細胞凋亡，這為從糖攝取及能量代謝方面治療黑色素瘤提供實驗與理論依據。

參考文獻：

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[2]Singh AK:Deciding oral drugs after metformin in type 2 diabetes:An evidence-based approach[J].Indian J Endocrinol Metab,2014,18(5):617.

[3]Li D.Metformin as an antitumor agent in cancer prevention and treatment[J].J Diabetes,2011,3(4):320.

[4]Zhang ZJ,Bi Y,Li S,et al.Reduced risk of lung cancer with metformin therapy in diabetic patients:a systematic review and meta-analysis[J].Am J Epidemiol,2014,180(1):11.

[5]Carless MA,Griffiths LR.Cytogenetics of melanoma and nonmelanoma skin cancer[J].Adv Exp Med Biol,2008,624:227.

[6]Eggermont AM,Robert C.New drugs in melanoma:it's a whole new world[J].Eur J Cancer,2011,47(14):2150.

[7]楊華,鄭勤.惡性黑色素瘤的免疫治療現狀與進展[J].現代腫瘤醫學,2011,19(11):2341.

[8]Del Barco S,Vazquez-Martin A,Cufi S,et al.Metformin:multi-faceted protection against cancer[J].Oncotarget,2011,2(12):896.

[9]Fujita Y,Hosokawa M,Fujimoto S,et al.Metformin suppresses hepatic gluconeogenesis and lowers fasting blood glucose levels through reactive nitrogen species in mice[J].Diabetologia,2010,53(7):1472.

[10]Kourelis TV,Siegel RD.Metformin and cancer:new applications for an old drug[J].Med Oncol,2012,29(2):1314.

[11]二甲雙胍對胃癌細胞株增生及Cyclin+D1表達的影響[J].國際外科學雜志,2010,37(3):171.

摘要：目的研究二甲雙胍在不同葡萄糖濃度下對小鼠黑色素瘤細胞B16增殖的影響并初步探討其可能機制。方法體外培養小鼠黑色素瘤細胞B16，采用不同糖濃度和二甲雙胍濃度作用，光鏡下觀察細胞形態，MTT法檢測細胞生存率， 流式細胞術檢測細胞凋亡率，Western blot檢測Cyt C表達。結果與對照組相比，隨著糖濃度的降低，B16細胞形態變的皺縮細長，細胞生存率逐漸降低并呈濃度劑量依賴性。在正常糖濃度和低糖濃度下，二甲雙胍均能抑制細胞生存率，隨著二甲雙胍濃度的增高，細胞凋亡率顯著增加，Cyt C表達水平增高。結論葡萄糖是小鼠黑色素瘤細胞B16細胞生存所必需條件之一，二甲雙胍在不同糖條件下均能顯著抑制B16細胞的生長，可能通過改變線粒體穩定性促進細胞凋亡。

關鍵詞：二甲雙胍；葡萄糖；細胞增殖；細胞凋亡

Effect of Metformin and Glucose on the proliferation in mouse melanoma B16 cellsLIYa-ping,SUNYue,XIAMei-hui,etal.(People′sHospitalofJilinProvince,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of Metformin and Glucose on the proliferation in mouse melanoma B16 cells and discuss its functional mechanism.MethodsB16 cells were cultured with different concentration of metformin and glucose in vitro.Cells morphology,viability,apoptosis and the expression of Cyt C protein were evaluated by light microscopy,MTT assay,flow cytometry and western blot respectively.ResultsCompared with the control group,morphology of B16 cells became wrinkled elongated,and the cell viability decreased in a concentration dose-dependent manner with the decrease of sugar concentration.Under normal glucose concentration and sugar concentration,metformin inhibited cell survival,significantly increased apoptosis rate,increased expression level of Cyt C.ConclusionGlucose is necessary for cell survival conditions of mouse melanoma B16 cells,metformin could significantly inhibit the growth of B16 cells and promote apoptosis by altering mitochondria under different sugar conditions.

Key words:Metformin；Glucose；Cell proliferation；Cell apoptosis

收稿日期：(2014-06-20)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R739.5

文章編號：1007-4287(2015)04-0536-04

通訊作者*

基金項目：吉林省衛生廳課題(20122Z126) ；中國博士后基金(2013M540256)；吉林省科技廳青年基金(20140520018JH)