天山一號冰川產蛋白酶酵母菌的篩選及其系統發育分析

趙有婷，孫海龍，劉敏瑞，于 洋，倪永清

(石河子大學食品學院，新疆石河子 832000)

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天山一號冰川產蛋白酶酵母菌的篩選及其系統發育分析

趙有婷，孫海龍，劉敏瑞，于 洋，倪永清*

(石河子大學食品學院，新疆石河子 832000)

[目的]篩選天山一號冰川底部沉積層耐低溫的產蛋白酶菌株，研究其生理生化特性并做系統發育分析。[方法]以天山一號冰川底部沉積層中耐低溫產蛋白的酵母菌株為材料，用Yeast Extract Peptone Dextrose Medium(YPD)培養基活化60株酵母菌；再用選擇性培養基篩選產蛋白酶的菌株，觀察菌落形態；測定產酶菌株最適溫度；最后基于26S r DNA基因D1/D2區序列進行系統發育分析。[結果]從60株酵母菌中共篩選出10株產蛋白酶菌株，其中產酶優勢菌為BCY-8、BCY-20，產酶酵母細胞平均大小為2.60～5.00 μm，最適生長溫度為24 ℃。經系統發育分析可知，10株產酶酵母菌屬于隱球菌(Cryptococcus)、紅酵母屬(Rhodotorula)、南極酵母(Antarcticyeast)、Unculturedfungus、Mazocraeoidesgonialosae。[結論]研究可為低溫蛋白酶生物技術的研發奠定基礎。

天山一號冰川；酵母菌；蛋白酶；系統發育

蛋白酶是水解蛋白質的一大類酶的通稱，廣泛存在于動物內臟、植物莖葉、植物果實和微生物中，自20世紀以來在食品、洗滌添加劑、飼料、造紙、制藥等行業中的應用價值極高，占世界用酶市場60% 以上的份額[1-2]。目前，從低溫微生物中篩選新的生物活性物質已成為新的研究熱點[3-4]。低溫酶是指在低溫環境中也能擁有高催化活性且對高溫敏感的一類酶，主要是由嗜冷菌(psychrophile)和耐冷菌(psychrotolerant)產生[4]。由于低溫酶在低溫環境下具有較高的酶活性，有助于在保證催化效率的前提下降低反應溫度和縮短反應時間，從而大幅度節約能源[5]。天山凍土屬于我國高海拔高山常年凍土，凍土環境中微生物會產生一系列適應低溫、寡營養、強輻射、凍融等極端因子的分子機制，為低溫微生物生理多樣性提供了可能。而目前國內對有關高海拔低溫蛋白酶菌株的研究報道較少[5-8]，主要研究大多來自南極及南海深部沉積層。筆者對天山一號底部沉積層中產蛋白酶的酵母菌株進行了分離、篩選，并研究了其系統發育多樣性，以期為低溫蛋白酶生物技術的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑和儀器。用于PCR擴增的全套試劑及擴增引物均購自TaKaRa公司，相關生理生化試驗所用試劑均購自于天津市巴斯夫化學試劑廠及天津市致遠化學試劑廠。高速冷凍離心機為Thermo 公司 Fresco21 型；PCR 儀為德國 Biometra 公司Tprofessional；凝膠成像系統為BioRad公司GelDOC XR；水平電泳儀為美國BioRad公司PowerPacUniversal、電泳槽 SUBCELL GT(20 cm×25 cm)。

1.1.2培養基。YPD液體培養基：酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L;葡萄糖過濾除菌，其他試劑高壓滅菌。YPD培養基：酵母提取物10 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L和酪蛋白20 g/L。YEPG培養基：YPD培養基加蛋白胨20 g/L。pH均為7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3供試菌種。 石河子大學食品學院實驗室從天山凍土帶凍土樣品中篩選鑒定所得的酵母菌。

1.2 菌株的活化與產蛋白酶菌株的篩選及菌落特征用YPD液體培養基活化-80 ℃保藏的酵母菌，再用YEPG培養基16 ℃培養24 h篩選產蛋白酶的菌株，以有無菌落透明圈作為初篩依據[5]。最后在YPD固體培養基上劃線，16 ℃培養1～7 d記錄菌落特性。

1.3 酵母菌生長較適溫度的測定按5%的接種量將60株菌接種于10 ml YPD液體培養基中，分別在16、20、24、28、37 ℃培養。用紫外分光光度計在波長420、600 nm下每隔10 h測定一次吸光值，共測5次。

1.4 26S rDNA基因的擴增和系統進化分析采用CTAB法提取酵母菌DNA，用NL1和NL4對酵母菌DNA進行26S rRNA基因擴增。反應體系(50 μl)，dNTP 1.0 μl、TaqDNA 0.2 μl、引物各2.0 μl、TaqDNA聚合酶10×緩沖液5.0 μl、2×TaqMasterMix 25.0 μl、MgCl2(2 mmol/l)4.0 μl，最后用去離子水補足。PCR循環：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，循環次數36次，72 ℃延伸10 min。PCR 產物由上海生工生物科技有限公司直接測序。所得序列用BLAST進行相關序列搜索， CLUSTAL X 1.83[9]軟件對齊序列，采用鄰接法neighbor-joining[10]和MEGA4.1[11]軟件構建進化樹，進化樹分支的置信度采用bootstrap法，重復次數為1 000。

2 結果與分析

2.1 篩選產蛋白酶酵母菌結果及菌落特性圖1為10株產蛋白酶菌里的部分菌株菌落形態及水解圈。用十字交叉法測定水解圈直徑及菌落直徑，產酶能力強：BCY-8、BCY-20；產酶能力較強：BYL-15、BYL-16、BCY-6；產酶能力較弱：BYL-1、BYL-24、BCY-16、BCY-21、BCY-29。

2.2 生長溫度測定結果圖2表明，10株產蛋白酶菌株中BYL-1、BCY-20、BCY-21、BLY-15、BYL-24的最適生長溫度范圍均在24 ℃左右；BCY-6、BCY-8、BYL-16最適生長溫度為16 ℃左右；BCY-16、BCY-29的最適生長溫度為28 ℃左右。

2.3 基于26S r RNA基因序列的酵母菌株系統發育分析由圖3可知，BYL-15與Unculturedbasidiomycota相似性為97%，BCY-16與Rhodotorulalaryngis相似性為98%。根據Kurtzman酵母種類的劃分依據，相似性低于99%的，不能劃為同一個種。BYL-16與Mazocraeoidesgonialosae相似性為99%。BYL-1屬于Cryptococcus，BYL-24屬于Unculturedfungus，BCY-8屬于Cryptococcus；BCY-6、BCY-16、BCY-20、BCY-21、BCY-29與Rhodotorula、Rhodotorulalaryngis、Antarcticyeast在同一分支中。

3 討論

根據文獻報道，低溫環境中分離的細菌大多數屬于耐冷細菌，最適生長溫度在20～25 ℃，只有部分菌株為專性嗜冷菌，最適生長溫度在10～15 ℃。綜上，BCY-6、BCY-8和BCY-20分別屬于產酶能力強的專性嗜冷菌和耐冷菌；BYL-15和BYL-16分別是產酶能力較強的專性嗜冷菌和耐冷菌。除BCY-16和BCY-29，其他均屬于產酶能力較弱的耐冷菌株。從系統發育來看，天山一號冰川底部沉積層中產蛋白酶的酵母菌主要隸屬于Acidobacteria門中Rhodotorula屬；而有文獻報道，目前所有冷凍低溫環境中隸屬于 Acidobacteria門的可培養細菌幾乎為零[1]。BCY-6和BCY-8菌落形態表型特征相同，均屬產酶能力強的專性嗜冷菌，但明顯BCY-6和BCY-8分別隸屬于Rhodotorula和Cryptococcus屬。說明依據菌落的差異標準不能準確反映冰川等冰凍圈環境中群落多樣性，需要采用更精確的分子手段確定。

[1] 倪永清,顧艷玲,史學偉，等.天山一號冰川底部沉積層產蛋白酶耐低溫菌株的篩選及其系統發育[J].微生物學報,2013，53(2):164-172.

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Screening and Phylogenetic Analysis of Yeast Producing Protease from Permafrost of the Glacier No.1 in the Tianshan Mountains

ZHAO You-ting, SUN Hai-long, LIU Min-rui, NI Yong-qing*et al

(College of Food Science, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832000)

[Objective] This research was to isolate cold-adapted protease-producing strains of yeasts from permafrost of the Glacier No.1 in the Tianshan Mountains, study their physiological and biochemical characteristics, conduct phylogeny analysis. [Method] YPD was used to select yeast producing protease, which were identified through the hydrolysis circle. Then, the optimum temperature of the strains and phylogenetic position determined by the 26S rDNA D1/D2 sequences was studied. [Result] 10 isolates were cold-adapted protease-producing strains. The average size of cells were 2.60 to 5.00 μm and the optimum growth temperature was 24 ℃. Phylogenetic analysis showed that the 10 strains of yeast belonged toCryptococcu,Rhodotorula,Antarcticyeast,UnculturedfungusandMazocraeoidesgonialosae. [Conclusion] The study can lay a foundation for research and development of low-temperature protease.

Tianshan glacier No.1; Yeast; Protease; Phylogeny

國家自然科學基金項目(40961002，41140009，41271268)。

趙有婷(1990-)，女，甘肅白銀人，碩士研究生，研究方向：微生物技術與酶工程。*通訊作者，教授，博士，從事微生物技術研究。

2014-11-19

S 188+.4

A

0517-6611(2015)01-248-03