CHD5和WWOX基因在胃癌中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響*

邢曉靜， 盧達(dá)新， 谷小虎

(1.遼寧省腫瘤醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110042 2.遼寧省撫順市第四醫(yī)院，遼寧 撫順 113015)

胃癌在全球惡性腫瘤中排行前列，全世界范圍內(nèi)均具有比較高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康［1］。胃癌屬于基因病，是長(zhǎng)期的、多階段的多基因突變并不斷累積的過(guò)程。遺傳或環(huán)境因素引起DNA改變的靶基因是原癌基因及抑癌基因，原癌基因被激活或者抑癌基因失活均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化［2］。近年來(lái)，國(guó)外學(xué)者在肝癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等研究中發(fā)現(xiàn)CHD5在腫瘤組織中異常表達(dá)，WWOX也出現(xiàn)低表達(dá)甚至不表達(dá)的情況，提示染色體質(zhì)域解螺旋酶DNA結(jié)合蛋白5(chromodomain helicase DNA-binding protein 5，CHD5)和 WWOX(WW domain-containing oxidoreductase)具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，同為抑癌基因［3，4］。目前國(guó)內(nèi)外鮮有 CHD5 和WWOX與胃癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的報(bào)道，本研究應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)CHD5和WWOX蛋白在胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，探討其與胃癌生物學(xué)行為之間的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料:隨機(jī)選取65例2011年3月至2012年8月期間在我院胃腸外科行根治手術(shù)的胃癌患者，全部患者均經(jīng)病理學(xué)診斷確診。納入標(biāo)準(zhǔn):患者術(shù)前均未行放化療、生物治療或中西醫(yī)結(jié)合治療。排除合并哮喘、慢性支氣管炎、自身免疫性疾病或嚴(yán)重肝腎功能不全等疾病的患者。65例患者中男35例，女30例，年齡45～72歲，平均年齡(58.42 ±12.96)歲。其中腫瘤癌灶＜5cm 31例，腫瘤癌灶≥5cm 34例。按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)TNM分期(2010年版)標(biāo)準(zhǔn)［5］劃分，Ⅰ～Ⅱ期患者有24例，Ⅲ～Ⅳ期患者有41例。胃癌組織病理分級(jí)為高、中、低分化的患者分別有14、20和31例。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者有27例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者38例。

1.2 檢測(cè)方法:采集患者胃癌組織及距腫瘤5cm的癌旁組織標(biāo)本，所有標(biāo)本均用經(jīng)10%甲醛固定、常規(guī)脫水和石蠟包埋，連續(xù)4μm切片。3%過(guò)氧化氫-甲醇以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，用微波抗原修復(fù)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，PBS代替一抗做陰性對(duì)照。采用免疫組化法檢測(cè)CHD5和WWOX蛋白在胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織的表達(dá)，兔抗人CHD5多克隆抗體和兔抗人WWOX多克隆抗體均購(gòu)于Santa Cruz公司，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行SP免疫組化染色步驟及抗體稀釋度操作。

1.3 結(jié)果判定:由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師雙盲法觀察切片，根據(jù)顯色比例和染色強(qiáng)度，對(duì) CHD5和WWOX蛋白的表達(dá)作半定量判斷。在低倍鏡下按照顯色程度進(jìn)行肉眼評(píng)分:弱染色為1分，中等染色為2分，強(qiáng)染色為3分。在低倍鏡下選5個(gè)視野，在高倍鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞所占總細(xì)胞數(shù)的百分率:10%～50%為2分，50% ～80%為3分，≥80%為4分。結(jié)合兩種評(píng)分進(jìn)行綜合判斷，陽(yáng)性細(xì)胞＜10%或低于2分者為陰性，2～3分為弱陽(yáng)性，4～7分為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，生存率采用Kaplan-Meier法計(jì)算，并用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHD5蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與不同臨床病理學(xué)特征的關(guān)系:CHD5蛋白在相應(yīng)癌旁組織中顯示高表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為72.31%(47/65);而在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率只有36.92%(24/65)，并且大多為弱陽(yáng)性表達(dá)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，CHD5蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡及腫瘤大小無(wú)關(guān)(P＞0.05)，但不同TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況下的陽(yáng)性表達(dá)率與其陰性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著TNM分期的增加，CHD5蛋白在胃癌組織中的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì);腫瘤細(xì)胞異型性越高，CHD5蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率越低;淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者CHD5蛋白的表達(dá)也明顯下降，見(jiàn)表1。

2.2 WWOX蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與不同臨床病理學(xué)特征的關(guān)系:WWOX蛋白的陽(yáng)性顆粒主要分布在腺體的細(xì)胞漿中。WWOX蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為41.54%(27/65)，在相應(yīng)癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為84.62%(55/65)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。WWOX蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率差異與患者的性別、年齡及腫瘤大小無(wú)關(guān)(P＞0.05)，但與TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)(P＜0.05)。TNM分期增加、腫瘤細(xì)胞異型性越高或淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移，WWOX蛋白在胃癌組織中的表達(dá)均下降，見(jiàn)表2。

表1 CHD5蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與不同臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

表2 WWOX蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與不同臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有轉(zhuǎn)移 27 20 7 25.93 5.730 0.023無(wú)轉(zhuǎn)移38 18 20 52.63

2.3 CHD5和WWOX蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌預(yù)后的相關(guān)分析:生存分析Kaplan-Meier法顯示，CHD5蛋白陰性表達(dá)患者的平均生存期為(21.54±2.66)月，陽(yáng)性表達(dá)患者的平均生存期為(56.12±6.73)月，CHD5蛋白陰性表達(dá)患者的1、3年生存率分別為73.17%、19.51%，顯著低于陽(yáng)性表達(dá)患者的1、3年生存率(95.83%、87.50%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。WWOX蛋白陰性表達(dá)患者的平均生存期為(21.04±1.78)月，陽(yáng)性表達(dá)患者的平均生存期為(50.08±3.95)月，WWOX蛋白陰性表達(dá)患者的1、3年生存率分別為73.68%、21.05%，顯著低于陽(yáng)性表達(dá)患者的1、3 年生存率(94.74%、78.95%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

胃癌是全世界常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移是一個(gè)非常復(fù)雜的病理生理學(xué)過(guò)程［6］。近幾年胃癌表觀遺傳學(xué)的研究證實(shí)胃癌的發(fā)生發(fā)展與多種抑癌基因功能改變存在密切關(guān)系，抑癌基因表達(dá)沉默屬于分子生物學(xué)上的改變。有以往報(bào)道指出，約30%胃癌患者有胃癌個(gè)體遺傳傾向，抑癌基因大型基因組片段內(nèi)出現(xiàn)缺失或點(diǎn)突變，但是大多數(shù)的胃癌患者發(fā)病機(jī)制不甚清楚［7］。近年來(lái)，卵巢癌、肝癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等的研究證實(shí)CHD5和WWOX出現(xiàn)低表達(dá)或表達(dá)缺失的情況，提示CHD5和WWOX可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用［8，9］。本研究通過(guò)免疫組化法對(duì)兩種基因的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了探討。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中CHD5和WWOX蛋白表達(dá)均較癌旁組織明顯下降，且其表達(dá)與TNM分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有明顯相關(guān)性，但與患者的性別、年齡及腫瘤大小無(wú)關(guān)，與羅登等［10］研究相一致。生存分析研究提示CHD5和WWOX蛋白陽(yáng)性表達(dá)的患者預(yù)后優(yōu)于陰性表達(dá)的患者，且其1、3年生存率明顯更高。CHD蛋白家族是SWI2/SNF2有關(guān)的ATP酶超家族成員之一，該家族含有DNA結(jié)合域、類(lèi)SWI2/SNF2 ATP酶/解旋酶域和染色質(zhì)調(diào)節(jié)域等結(jié)構(gòu)。CHD5蛋白是一組重要的染色體非組蛋白，位于1p36基因組片段內(nèi)，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)染色體結(jié)構(gòu)促進(jìn)p19arf的表達(dá)，p19arf能維持p53的穩(wěn)定表達(dá)，50%以上的癌癥都與p53的表達(dá)缺失有關(guān)，所以CHD5可能是通過(guò)p19arf/p53通路來(lái)調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)。含有WW結(jié)構(gòu)域的氧化還原酶基因WWOX是通過(guò)鳥(niǎo)槍基因測(cè)序技術(shù)鑒別出的一種抑癌基因，位于染色體脆性位點(diǎn)FRA16D上，在致癌環(huán)境的作用下容易失活。WWOX蛋白含414個(gè)氨基酸，是具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用的蛋白，并參與了多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路:與IκBα/p53凋亡途徑的p53作用;增強(qiáng)TNF的介導(dǎo)作用，使細(xì)胞毒性增加，也與TNF凋亡途徑的TRAF2和TRADD作用等。WWOX蛋白主要存在于線(xiàn)粒體中，凋亡應(yīng)激因素蒼術(shù)苷、十字胞堿、TNF等加強(qiáng)WWOX蛋白的合成，讓第一個(gè)WW結(jié)構(gòu)域中的Try33發(fā)生磷酸化，改變了線(xiàn)粒體通透性，WWOX蛋白從線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)至細(xì)胞核，使促凋亡因子p53上調(diào)、抗凋亡因子Bcl-Xl和Bcl-2下調(diào)，從而增強(qiáng)TRADD介導(dǎo)的細(xì)胞死亡及TNF介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。因此認(rèn)為CHD5和WWOX均為抑癌基因，與胃癌的進(jìn)展關(guān)系密切，CHD5和WWOX蛋白在胃癌組織中的表達(dá)下降或缺失，具有增加TNM分期、提高腫瘤細(xì)胞異型性或促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。但畢竟腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是受到多種因素影響的，是多種基因相互協(xié)調(diào)的結(jié)果，而本研究樣本容量不大，且未深入研究CHD5和WWOX蛋白與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系，因此有待擴(kuò)大樣本容量進(jìn)一步探索。

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