非小細胞肺癌中VEGF-936C/T多態位點相關分析

非小細胞肺癌中VEGF-936C/T多態位點相關分析

楊桂香1，胡衛盟2，齊迎松2

(1.河北省寬城滿族自治縣醫院，河北寬城067600

2.河北省承德市中心醫院，河北承德067000)

摘要：目的：檢測非小細胞肺癌患者血清中VEGF表達水平，探討其與非小細胞肺癌發生和發展的關聯性，并檢測其基因位點936C/T多態性與非小細胞肺癌的遺傳易感性。方法：運用ELISA法及聚合酶鏈式反應-連接酶檢測反應方法檢測80例非小細胞肺癌患者和80例健康體檢者外周血中VEGF的表達水平，對其基因位點936C/T多態分型進行檢測，并分析與非小細胞肺癌的相關性。結果：非小細胞肺癌組VEGF表達水平顯著高于對照組，P=0.001(P<0.05)，差異具有統計學意義；兩組間的基因型頻率(χ2=0.960，0.7500.05)和等位基因頻率(χ2=0.968，0.2500.05)差異無統計學差異，基因型與非小細胞肺癌組的相關性分析(PTC=0.554，PTT=0.670，P>0.05)差異亦無統計學意義。結論：VEGF在非小細胞肺癌中呈過表達狀態，且VEGF與非小細胞肺癌的發生、發展具有相關性；但VEGF基因位點936C/T多態與非小細胞肺癌的發生、發展并無明顯相關性。

關鍵詞：非小細胞肺癌;血管內皮生長因子;單核苷酸多態性;遺傳易感

文章編號：1006-6233(2015)09-1559-05

文獻標識碼：B

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因，約占全部惡性腫瘤死亡率的20%，其發生率和死亡率呈逐年上升趨勢，其中有80%為非小細胞肺癌[1]。研究發現，非小細胞肺癌惡性度高，預后差，易于早期轉移等生物學特性與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)有關[2]。VEGF基因具有多態性，然而，在國內關于VEGF基因單核苷酸多態性與肺癌發展關系的報道相對較少，本研究的目的是探討血清中VEGF表達水平及其基因位點936C/T多態與人群肺癌易感性的關系，進而為非小細胞肺癌的早期風險性評估、早期診斷與預防以及相應的治療等諸多方面提供依據。

1資料與方法

1.1臨床資料:選擇我醫院2010年9月至2012年5月經病理確診的非小細胞肺癌患者80例，且患者無其它血管病變，采血前1周內未經過任何手術、放療、化療或免疫治療，其中男52例，女28例，年齡45～72歲，中位年齡55歲，按照世界衛生組織肺癌分類標準：鱗癌32例，腺癌36例，大細胞癌8例，腺鱗癌4例。按照國際抗癌聯盟(UICC)第七版標準進行TNM分期，其中Ⅰ期10例、Ⅱ期39例、Ⅲ期25例)，Ⅳ期6例。對照組為同期健康且排除其它血管病變疾病的體檢者80例，其中男54例，女26例，年齡35～76歲，平均52.6歲。所有標本及臨床資料的收集均征得患者同意并簽署了知情同意書。

1.2主要儀器設備:BioRad450酶標儀、Wizard基因組DNA純化試劑盒、東勝龍黑金剛EDC-810PCR儀、3730XL基因測序儀、Allegra25R臺式高速冷凍離心機、Micro 17R微量臺式離心機、微量可調移液器、Taq酶、dNTP、Taq DNA ligase(上海捷瑞生物工程有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1血液標本采集:符合入選標準的所有受檢者分別于清晨空腹狀態下采肘靜脈血4mL于EDTA管中，在1h內離心(3000r/min離心15min)，分離血清，取上清液(eppendorf離心管)，分裝保存于-20℃冰箱待測。VEGF血清水平測定采用ELISA法。

1.3.2基因組DNA的提取:上述血液標本3000r/min離心15min，分離血細胞，取沉淀物。DNA的提取采用嚴格按照Wizard基因組DNA純化試劑盒的說明書進行純化提取：取一只1.5mL無菌小離心管，加入900ul細胞裂解液；輕振血樣試管，直至徹底混勻，然后將血樣轉移至上述加有細胞裂解液的離心管中，顛倒混勻5～6次；室溫孵育10min(期間顛倒離心管2～3次混勻，一次)裂解紅細胞，13,000～16,000xg室溫離心20s；能將上清移棄干凈，剩余約10～20ul液體；重復上述操作，直到沉淀變白；使用渦旋振蕩器(Votex)劇烈混勻，直至白細胞重懸(10～15s)；向重懸細胞溶液中加入核裂解液，用移液槍頭吸放溶液5～6次裂解白細胞，若混合后可見細胞團塊，則將溶液置于37℃孵育直至團塊消散；向核裂解物中加入蛋白沉淀液100ul，用渦旋振蕩器劇烈振蕩10～20s；于16,000xg室溫離心3min；將其上清轉至裝有300ul室溫異丙醇的1.5mL干凈的離心管中；輕輕顛倒以混勻溶液，直至白色線狀DNA形成沉淀；于16,000xg室溫離心1min；棄去上清，加入與樣本量等體積的室溫70%乙醇，輕輕顛倒離心管數次清洗DNA沉淀和管壁，依照12步離心；使用巴斯德吸管或測序加樣槍頭小心吸走乙醇溶液，此時的DNA沉淀十分松弛，應格外小心避免將DNA沉淀吸進管中。將離心管倒置在干凈的吸水紙上，自然干燥10～15min；向離心管中加入DNA溶解液 (DNA RehydrationSolution)100ul；65℃孵育1h溶解 DNA。期間可輕彈管壁混勻溶液；2～8℃保存 DNA。

1.3.3SNP分型:采用聚合酶鏈式-連接酶檢測反應方法對VEGF 基因位點936 C/T(rs3025039)進行分型。上游引物為：AAACCTGAAATGAAGGAAGAG，下游引物：GTGGGTGGGTGTGTCTACAGG。TC探針：TTTTCATTCCCGGGCGGGTGACCCAGCAC，TT探針TTTTTTTCATTCCCGGGCGGGTGACCCAGCAT，TR探針：-P-GGTCCCTCTTGGAATTGGATTCGCCTTT-FAM-，擴增目標片段的長度是208bp。PCR反應體系為15ul,94℃預變性3min，然后94℃變性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，共循環30次，最后72℃延伸3min。LDR反應體系為10ul，94℃30s，56℃3min，循環30次進行連接反應，取1ul延伸產物，加8ul上樣loading，95度C變性3min，立即冰水浴，上測序儀。

2結果

2.1非小細胞肺癌組與對照組血清VEGF的表達水平:經檢測VEGF血清水平符合正態分布，非小細胞肺癌組VEGF表達平均水平為211.75pg/mL，對照組為150.79pg/mL，非小細胞肺癌組VEGF表達水平顯著高于對照組通，P=0.001(P<0.05)，差異有統計學意義，且非小細胞肺癌組平均水平明顯高于對照組,，證明VEGF可能與腫瘤的發生發展有相關性。見表1。

表1　非小細胞肺癌組與對照組血清VEGF水平(pg/mL)

2.2VEGF-936C/T等位基因頻率的表達:正常對照組VEGF-936C/T等位基因頻率經遺傳平衡檢驗，其分布符合Hardy-Weinberg定律(χ2=0.794，P>0.05),說明調查的正常群體具有代表性。VEGF-936C/T基因多態位點的分型結果如圖1所示。CC、TT、CT基因型在非小細胞肺癌組中分布頻率分別為65.0%、6.3%、28.7%，在對照組中分布頻率為70.0%、5.0%、25.0%，兩組間基因頻率分布差異并無統計學意義(χ2=0.960，0.750

表2　VEGF-936C/T基因型分布及等位基因頻率比較 n(%)

2.3VEGF-936C/T基因多態性與非小細胞肺癌遺傳易感的關系:在非條件邏輯回歸分析中，以CC基因型為參照，TC基因型與CC基因型比較，兩組間基因型分布無差異，(OR=1.24，95%CI =0.61～2.52， P>0.05)，TT基因型與CC基因型比較。兩組間分布無顯著差異，(OR=1.35，95%CI =0.61～2.520.34～5.29，P>0.05)。VEGF-936C/T基因多態性基因型與非小細胞肺癌的遺傳易感性并無顯著關聯。見表3。

圖1　VEGF-936C/T多態位點的分型結果圖

基因型對照組(n=80)No(%)非小細胞肺癌組(n=80)No(%) OR(95%CI) P值CC56(70.0)52(65.0)1.00TC20(25.0)23(28.7)1.24(0.61～2.52)0.554TT4(5.0)5(6.3)1.35(0.34～5.29)0.670

3討論

非小細胞肺癌是肺癌最常見的病理類型，肺癌發生侵襲和轉移是致使患者死亡的首要原因[3]。大量的研究發現，新生毛細血管的形成是原發實體腫瘤細胞的增殖和生長、轉移的必須條件，有多種因素影響新生血管的形成，其中VEGF就是一種高度特異的血管調控因子，在新生血管的形成中起極其重要的作用[4]。大量的研究證實，高表達的VEGF能夠促進腫瘤的生長和轉移，而當阻斷VEGF的信號轉導途徑時，腫瘤血管生成和腫瘤自身的生長將會受到影響[5]。

研究表明，VEGF在多種腫瘤組織中呈高表達狀態，并且與腫瘤的發生發展具有密切的關聯性。VEGF是一種同型二聚體糖蛋白，其基因定位于染色體6p21.3，是一個14-kb的編碼區，具有8個外顯子和7個內含子。VEGF基因中至少有30個單核苷酸多態性位點(SNPs)，目前有研究證實，其中有的位點與VEGF基因自身的表達具有相關性[6]。單核苷酸多態性位點936 C/T(rs3025039)是VEGF基因中最常見的多態位點，有學者報道，在對VEGF-936T多態位點分析進行研究中發現，攜帶VEGF-936T多態位點者患乳腺癌的危險性較低[7]，而Kammerer等學者研究發現，VEGF-936T基因多態性能促進口腔鱗狀細胞癌的進展[8]。VEGF基因單核苷酸多態性位點-2578C/A、-460C/T和+405C/G，參與了肺癌的發展，但關于VEGF936C/T基因多態性與肺癌的關系的研究較少，且對于VEGF936C/T與人群肺癌易感性的關聯仍存在爭議。

本研究對非小細胞肺癌患者及健康人群中血清VEGF表達水平進行了分析，結果顯示非小細胞肺癌組VEGF水平顯著高于健康對照組，兩者具有統計學差異(p<0.05)。不同分期間VEGF表達水平的比較，研究發現VEGF的水平隨著腫瘤分期有逐漸升高的趨勢，表明VEGF與非小細胞肺癌的發生發展具有相關性，且可用VEGF水平推測病情進展情況。此外本研究通過對VEGF基因位點936C/T多態性進行分析，結果顯示兩組間基因型及等位基因差別并無統計學意義；CC、TT、CT基因型在非小細胞肺癌組中分布頻率與正常對照組中分布頻率的比較結果顯示，兩組間基因頻率分布差異并無統計學意義(χ2=0.960，0.7500.05具體值)。C和T等位基因差異亦無統計學意義(χ2=0.968，0.2500.05)。這與Liu等[9]學者的研究報道相一致。以CC基因型作參照，TC及TT基因型與非小細胞肺癌的發病無明顯相關。

參考文獻:

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