荔枝殼原花青素對膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡的作用及其機制研究

張曉暉，孫智達，李書藝，曾繁典，熊益群，徐超英，劉心亮，林　堅，穆桂萍，徐紹鋼，劉文赫(.深圳市中醫院中醫藥研究所，廣東深圳　580;.華中農業大學食品科學技術學院，湖北武漢　0070; .武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北武漢　00;.華中科技大學同濟醫學院藥理系，湖北武漢　000)

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荔枝殼原花青素對膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡的作用及其機制研究

張曉暉1，孫智達2，李書藝3，曾繁典4，熊益群1，徐超英1，劉心亮1，林堅1，穆桂萍1，徐紹鋼1，劉文赫1
(1.深圳市中醫院中醫藥研究所，廣東深圳518033;2.華中農業大學食品科學技術學院，湖北武漢430070; 3.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北武漢430023;4.華中科技大學同濟醫學院藥理系，湖北武漢430030)

中國圖書分類號: R-332; R284.1; R322.11; R329.25; R631. 022

摘要:目的研究荔枝殼原花青素(Procyanidins extracted from the litchi pericarp，LPPC)對膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡的作用及其機制。方法實驗大鼠隨機分為5組，連續灌胃兩周:空白對照組(control)和膿毒癥模型組(LPS)每天給予蒸餾水灌胃1次; LPPC低、中、高劑量組分別每天給予新鮮配制的LPPC 50，100，200 mg·kg－1·d－1灌胃1次。給藥結束后，建立膿毒癥動物模型。即除空白對照組外所有大鼠腹腔內注射LPS(lipopolysacchride，10mg·kg－1，ip)誘導急性膿毒癥模型。4 h后收集大鼠血清，檢測血清同工酶(CKMB)、乳酸脫氫酶(LDH)和谷草轉氨酶(AST/GOT)的活力。取大鼠心肌組織，測定心肌組織丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量。TUNEL染色觀察大鼠心肌細胞凋亡情況。Western blot法檢測凋亡相關蛋白Cleaved caspase-3及TNF-α水平。結果與正常對照組(control)比較，膿毒癥模型組大鼠血清CK-MB、LDH、AST/GOT以及心肌組織MDA含量均明顯升高(P＜0. 01);同時，心肌組織T-AOC和GSH的活力明顯降低(P＜0. 01);凋亡心肌細胞數量明顯增加(P＜0. 01); Cleaved caspase-3及TNF-α表達水平明顯下降(P＜0. 01)。LPPC預處理明顯降低了大鼠血清CK-MB、LDH、AST/GOT以及心肌組織MDA含量;增加了大鼠心肌組織T-AOC和GSH的活力;凋亡心肌細胞數量明顯減少; Cleaved caspase-3及TNF-α表達水平明顯下降。結論荔枝殼原花青素預處理能夠明顯減輕膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡，可能與其抗氧化性損傷作用有關。

關鍵詞:荔枝殼原花青素;膿毒癥;心肌細胞;凋亡;氧化應激;大鼠

網絡出版時間:2015－6－5 11:22網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.009.html

原花青素是自然界來源豐富的多酚類植物化合物，由不同數量的兒茶素或表兒茶素結合而成。20世紀中葉法國科學家馬斯·魁勒首次闡明松葉泡汁中的原花青素和維生素C都是防治壞血病的有效物質，從而為原花青素的應用指明了前景［1］。原花青素廣泛存在于多種植物中，目前已發現其在葡萄籽、蓮子殼、荔枝殼、松樹皮、廢棄油菜籽皮、蠶豆皮、沙棘籽、高粱種皮、黑豆等中含量均較豐富。除了抗氧化活性外，它還具有多種生物學活性，如抗炎［2］、抗腫瘤［3］、保護心血管［4］等，其中以抗氧化及清除自由基的功能最為突出。其抗氧化的效果遠遠優于維生素C、維生素E和β-胡蘿卜素等傳統抗氧化劑。

荔枝(Litchi chinesis Sonn.)是無患子科常綠植物所結果實，我國主要產于廣東、福建、廣西等地，是亞洲特產水果，深圳的“南山荔枝”更是享譽海內外。其營養豐富，味甜肉嫩，色澤鮮艷，素有“嶺南果王”之稱。荔枝殼重量占果實總重的16%左右，含有多種活性成分，其藥用價值很高，早在明朝李時珍就曾在《本草綱目》中記載:果殼、果核可入藥，治鼻衄、療疝氣、止血止痛。近代的一些研究也提示荔枝殼中富含類黃酮，如黃酮醇、花青素和原花青素等生物活性物質。荔枝殼原花青素(Procyanidins extracted from the litchi pericarp，LPPC)是華中農業大學食品科技學院天然作物實驗室率先從荔枝果殼中提取出，并通過結構鑒定和功能分析，確定荔枝殼中的原花青素包括A型和B型兩種，以A型為主，延伸單元和末端單元為表兒茶素，通過4→8，2→O→7 或4→6，4→8連接而成。目前研究發現，LPPC具有良好的抗氧化清除自由基［5］、體外抑菌活性［6］、抗動脈粥樣硬化作用［7］及抗癌活性［8］。本課題旨在研究LPPC是否對膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡的具有保護作用，并尋找其作用機制，從而找到其新的作用靶點，為開發利用LPPC膿毒癥心血管保護的功能提供理論依據，尋找LPPC的潛在利用價值。

1　材料與方法

1.1主要材料

1.1.1實驗動物健康成年♂SD大鼠，體質量250～300 g，購自廣東省實驗動物中心。

1.1.2藥品荔枝殼原花青素(LPPC)由華中農業大學食品科學技術學院孫智達教授提供。LPPC溶解性好，可直接溶解于蒸餾水制成溶液，灌胃給藥。

1.1.3試劑cleaved caspase-3一抗、TNF-α一抗(Cell Signaling Technology)，HRP標記二抗、ECL(Forevergen)，TUNEL試劑盒(Roche)，CK-MB ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司);乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、谷草轉氨酶(AST/GOT)測試盒、丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力測定試劑盒、還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒(分光光度法)均為南京建成生物工程有限公司產品。

1.2分組與造模實驗動物適應性喂養2周后，隨機分為5組，連續灌胃兩周:空白對照組(control，CON)和膿毒癥對照組(LPS)每天給予蒸餾水灌胃1 次; LPPC低劑量組、中劑量組、高劑量組分別每天給予新鮮配制的LPPC 50、100、200 mg·kg－1·d－1灌胃1次。

給藥結束后，建立膿毒癥動物模型。即除空白對照組外所有大鼠腹腔內注射LPS(10 mg·kg－1，ip)誘導急性膿毒癥模型。LPS處理4 h后，出現豎毛、淡漠、腹瀉等膿毒癥體征的清醒大鼠被用于實驗。正常對照組動物注射生理鹽水(1 ml·kg－1，ip)。

4 h后，以4%水合氯醛麻醉大鼠，打開腹腔，行腹主動脈取血。全血經室溫靜置2 h后4℃1 000× g離心30 min，收集上清液，分裝于－80℃凍存。摘取心臟分為兩部分，一部分用4℃預冷的多聚甲醛(PFA)固定;另一部分液氮凍存備用。

1.3檢測指標

1.3.1血清心肌酶學指標檢測血液離心后取上清，按照試劑盒說明制作標準曲線，測定血清同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)和谷草轉氨酶(AST/GOT)的活力。

1.3.2心肌組織抗氧化能力檢測取左心室心肌組織，制備組織勻漿，按照試劑盒說明制作標準曲線，測定心肌組織丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量。

1.3.3 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡心肌組織固定，制作蠟塊切片，應用末端脫氧核糖核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)檢測凋亡心肌細胞。按照TUNEL試劑盒說明書逐步添加試劑，光學顯微鏡下觀察、拍照。每個心臟觀察3張切片，每張切片隨機選取5個非重疊的400×高倍鏡視野，計算凋亡指數AI(凋亡心肌細胞數/心肌細胞總數×100%)，求其均值。

1.3.4 Western blot法檢測凋亡相關蛋白水平采用預冷的PBS沖洗心室肌組織，冰上剪碎，充分勻漿，以5 000 r·min－1離心10 min，棄上清后加入裂解液，12 000 r·min－1離心10 min，取上清于低溫冰箱保存。采用BCA法檢測蛋白濃度。將蛋白與上樣緩沖液混勻后煮沸10 min。每孔取30μg蛋白質上樣，行15%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用半干轉法轉膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入Cleaved caspase-3(1∶1 000)及TNF-α(1∶1 000)的一抗，4℃孵育過夜，同時以GAPDH作為內參(1∶5 000)，加入二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h。采用化學發光法進行膠片顯影，采用Image J進行目的條帶的光密度分析，最終結果以目的條帶的光密度與內參的比值作為最終結果。

1.4統計學分析采用SPSS 11. 5軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，組間均數比較采用方差分析。

2　結果

2.1 LPPC對膿毒癥大鼠血清CK-MB、LDH以及AST的影響CK-MB、LDH和AST是一系列心肌損傷血清標記物。如Tab 1所示，膿毒癥模型組大鼠血清CK-MB、LDH和AST各項指標相比正常對照組都有明顯的提高(P＜0. 01)，說明膿毒癥能明顯提高大鼠血清心肌酶譜指標水平。經LPPC預處理后，LPPC各劑量組均不同程度降低膿毒癥大鼠血清CK-MB水平(P＜0. 05)。LPPC中、高劑量組能明顯降低膿毒癥大鼠血清LDH水平(P＜0. 05)。LPPC高劑量組能明顯降低膿毒癥大鼠血清AST水平(P ＜0. 01)。說明應用LPPC后，可在一定程度上改善LPS誘導的大鼠心肌細胞損傷。

Tab 1　Effect of LPPC on serum CK-MB，LDH and AST of septic rat(±s，n =10)

Tab 1　Effect of LPPC on serum CK-MB，LDH and AST of septic rat(±s，n =10)

Group　CK-MB/U·L－1　LDH/U·L－1　AST/U·L－1Control　197.21±26.92 　350.96±22.84 　197.19±32.22 LPS　257.67±29.88＊＊775.70±38.28＊＊402.62±26.82＊＊LPPC 50 mg·kg－1·d－1　230.34±21.76△　746.12±30.69 　377.22±40.23 LPPC 100 mg·kg－1·d－1　227.40±33.69△　726.64±42.87△　353.68±50.57 LPPC 200 mg·kg－1·d－1　218.76±38.00△　677.06±59.59△　331.66±54.15△△＊＊P＜0. 01 vs control group;△P＜0. 05，△△P＜0. 01 vs LPS group

2.2 LPPC對膿毒癥大鼠心肌組織MDA、GSH以及T-AOC的影響如Tab 2所示，膿毒癥模型組大鼠心肌組織MDA含量明顯高于正常組(P＜0. 01)，而GSH和T-AOC的水平明顯低于正常組(P＜0. 01)，說明膿毒癥模型動物氧化應激水平高于正常。經LPPC預處理后，LPPC各劑量組均不同程度降低膿毒癥大鼠心肌組織MDA含量(P＜0. 05或P ＜0. 01)，并具有劑量依賴性。LPPC高劑量組能明顯降低膿毒癥大鼠心肌組織GSH含量(P＜0. 05)。LPPC中、高劑量組能明顯降低膿毒癥大鼠心肌組織T-AOC水平(P＜0. 05或P＜0. 01)。說明應用LPPC后，可在一定程度上改善LPS誘導的大鼠心肌細胞氧化應激水平。

Tab 2　Effect of LPPC on cardiac tissue MDA，GSH and T-AOC of septic rat(±s，n =10)

Tab 2　Effect of LPPC on cardiac tissue MDA，GSH and T-AOC of septic rat(±s，n =10)

＊＊P＜0. 01 vs control group;△P＜0. 05，△△P＜0. 01 vs LPS group

Group　MDA/μmol·g－1Pro GSH/kU·g－1Pro T-AOC/kU·g－1Pro Control　3.63±0.44 　22.24±2.93 　4.30±0.48 LPS　7.97±0.53＊＊　14.85±2.50＊＊　2.12±0.69＊＊LPPC 50 mg·kg－1·d－1　7.10±0.66△△　14.53±3.31 　2.33±0.50 LPPC 100 mg·kg－1·d－1　5.98±0.73△△　17.36±3.77 　2.68±0.47△LPPC 200 mg·kg－1·d－1　5.38±0.70△△　17.55±2.40△　3.98±0.88△△＊＊P＜0. 01 vs control group;△P＜0. 05，△△P＜0. 01 vs LPS group

Fig 1　Level of rat cardiac myocytes apoptosis detected by TUNEL staining(±s)＊＊P＜0. 01 vs control group;△△P＜0. 01 vs LPS group

2.3 LPPC對膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡的影響

TUNEL法染色檢測心肌細胞凋亡的情況見Fig 1。與Control組相比，單純LPS處理組大鼠心肌細胞AI值明顯上升(P＜0. 01)，說明膿毒癥大鼠心肌中有大量心肌細胞凋亡。LPS + LPPC各處理組與單純LPS處理組相比，AI值均不同程度下降(P＜0. 01)，且具有劑量依賴性。說明應用LPPC后，可有效抑制LPS誘導的大鼠心肌細胞凋亡。

2.4 LPPC對膿毒癥大鼠心肌組織Cleaved caspase-3和TNF-α蛋白表達的影響Cleaved caspase-3和TNF-α蛋白在正常對照組(Control組)的大鼠心肌組織中幾乎不表達。單純LPS處理組與Control組相比，Cleaved caspase-3和TNF-α蛋白表達水平明顯升高(P＜0. 01)。LPS + LPPC各處理組與單純LPS處理組相比，Cleaved caspase-3和TNF-α蛋白表達水平均不同程度下降(P＜0. 05或P＜0. 01)，且具有劑量依賴性。

3　討論

膿毒癥(sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，是創傷、燒傷、休克、感染、大手術等臨床急危重患者的嚴重并發癥之一，也是誘發膿毒性休克(septic shock)、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的重要原因。膿毒癥合并心功能衰竭，死亡率高達70%～90%［9］，臨床救治相當困難。近來的研究發現，膿毒癥心功能不全與細胞凋亡［10］有關。凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下，受內在機制的控制主動結束生命的過程，并伴隨有典型的形態學改變，常涉及半胱氨酸蛋白酶(caspases)或TNF-α等促凋亡介質的活化。

我們的研究結果發現，與正常對照組大鼠比較，膿毒癥模型組大鼠凋亡心肌細胞數量明顯增加，caspase-3及TNF-α表達水平明顯下降(P＜0. 01)。LPPC預處理能減少凋亡心肌細胞數量以及caspase-3和TNF-α的表達。可能與其抗氧化性損傷有關。

最近的研究表明，氧化應激在膿毒癥心肌細胞凋亡的發生、發展過程中發揮了重要作用［11］。膿毒癥心肌可產生大量的活性氧(ROS)，后者可導致心肌細胞膜的脂質雙分子層發生過氧化反應，使其功能和活性降低，造成心肌細胞損傷;同時ROS也可損害線粒體膜，引起caspase-3活化，繼而啟動凋亡程序，導致心肌細胞損傷。MDA是一種重要的細胞膜脂質過氧化反應產物，其在組織中的含量可直接反應機體脂質過氧化的強度;而體內的抗氧化系統，如GSH等則能減少氧自由基對細胞的損傷，可用來評價機體清除氧自由基的能力。本研究結果發現，膿毒癥大鼠心肌組織MDA含量明顯增高，而GSH，T-AOC水平明顯下降，提示膿毒癥大鼠體內氧化應激明顯增強。經LPPC預處理的膿毒癥大鼠MDA含量明顯減少，GSH，T-AOC水平明顯恢復，說明LPPC用于預防膿毒癥心肌細胞凋亡可能與其抗氧化應激作用有關。

Fig 2　Expression level of rat cardiac tissue caspase-3 and TNF-α by Western blot analysis(n =4，±s)＊＊P＜0. 01 vs control group;△P＜0. 05，△△P＜0. 01 vs LPS group

TNF-α是參與膿毒癥全身炎性反應的重要炎癥介質之一，心肌細胞是TNF-α的靶細胞，其自身也可分泌TNF-α，心肌組織中TNF-α的含量可用來反映膿毒癥心肌組織炎癥的程度。本實驗觀察到，膿毒癥大鼠中TNF-α水平明顯升高(P＜0. 01)，而LPPC預處理可以抑制膿毒癥大鼠心肌組織中TNF-α水平的升高(P＜0. 01)，提示其可以通過減少心肌組織中炎癥因子TNF-α的浸潤發揮抗炎作用，達到保護心臟的目的。

Caspase-3是一類天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，其激活在心肌細胞凋亡的發生中起重要的作用。Caspase-3是凋亡的最終執行者，在凋亡級聯激活中處于核心地位［12］。我們的研究發現，在膿毒癥大鼠心肌組織中，caspase-3蛋白表達水平升高(P＜0. 01)，而LPPC干預可以使其表達水平部分恢復，說明LPPC正是通過抑制具有生物活性功能的caspase-3的產生，從而降低膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡率，減輕心肌損害。LPPC干預確有抗膿毒癥大鼠心肌組織細胞凋亡的作用。

本實驗結果顯示，膿毒癥大鼠血清CK-MB、LDH、AST/GOT以及心肌組織MDA含量均明顯升高，同時，心肌組織T-AOC和GSH的活力明顯降低，提示心肌損傷明顯。心肌組織中凋亡細胞數量明顯增多，且心肌組織中Cleaved caspase-3及TNF-α含量明顯增高，提示膿毒癥大鼠心肌損傷的發生與TNF-α以及細胞凋亡有關。在給予不同劑量的LPPC預處理后，明顯降低了大鼠血清CK-MB、LDH、AST/GOT以及心肌組織MDA含量;增加了大鼠心肌組織T-AOC和GSH的活力;凋亡心肌細胞數量明顯減少; Cleaved caspase-3及TNF-α表達水平明顯下降。說明荔枝殼原花青素預處理能夠明顯減輕膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡，可能與其減輕炎癥介質的產生以及抗氧化應激性損傷作用有關。

致謝:本文實驗在深圳市中醫院國家中醫藥科研三級實驗室(No: TCM-2009-289)完成，在此表示衷心感謝。

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Protective effects of LPPC on cardiomyocyte apoptosis in septic rats

ZHANG Xiao-hui1，SUN Zhi-da2，LI Shu-yi3，ZENG Fan-dian4，XIONG Yi-qun1，XU Chao-ying1，LIU Xin-liang1，LIN Jian1，MU Gui-ping1，XU Shao-gang1，LIU Wen-he1
(1.Chinese Medicine Institute of Shenzhen TCM Hospital，Shenzhen Guangdong 518033，China;
2.College of Food Science and Technology of Huazhong Agriclultual University，Wuhan 430070，China;
3.College of Food Science and Engineering of Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China;
4.Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China)

Abstract:Aim To explore the protective effects of LPPC(procyanidins extracted from the litchi pericarp)on cardiomyocyte apoptosis in septic rats and its mechanisms.Methods The rats were randomly divided into 5 groups，and were given orally the drug for two weeks continuously.The control group(control)and sepsis model group(LPS)were given distilled water once a day.LPPC low，medium and high dose groups were given LPPC 50，100，200 mg·kg－1·d－1respectively which were prepared freshly every day.After the treatment，sepsis animal models were established.Except for the control group，other groups were injected LPS(lipopolysacchride，10mg·kg－1)intraperitoneally to induce acute sepsis model.4hrs later，rat serum was collected，isoenzyme(CK-MB)，lactate dehydrogenase(LDH)and activity of aspertate aminotransferase(AST/GOT)were detected.Then rat cardiac tissue was obtained and cardiac tissue malondialdehyde(MDA)，total antioxidant capacity(T-AOC)and reduced glutathione(GSH)content were determined.TUNEL staining was performed to analyze the apoptosis of myocardial cells.Cleaved caspase-3 and TNF alpha protein expressions were analyzed by Western blot.Results Compared with the control group(control)，serum of sepsis model group rats CK-MB，LDH，AST/GOT and cardiac tissue MDA content were significantly increased(P＜0. 01).At the same time，the activity of cardiac tissue T-AOC and GSH decreased obviously(P＜0. 01).The apoptotic myocardial cells increased significantly(P＜0. 01)，and the expression level of cleaved caspase-3 and TNF alpha decreased obviously(P＜0. 01).LPPC pretreatment significantly decreased the serum CK-MB，LDH，AST/GOT and tissue MDA content，increased tissue T AOC and GSH activity，attenuated apoptosis of rat myocardial cells significantly，and decreased expression level of cleaved caspase-3 and TNF alpha.Conclusion LPPC pretreatment can significantly attenuate rat myocardial cell apoptosis induced by sepsis，and the underlying mechanisms may be related to its anti-oxidative effects.

Key words:LPPC; sepsis; cardiomyocyte; apoptosis; oxidative stress; rat

作者簡介:張曉暉(1975－)，女，博士，副主任藥師;研究方向:心血管藥理學、中藥藥理學，通訊作者，Tel: 0755-88359666，E-mail:767682665@ qq.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目(No 81101450);深圳市科技研發資金知識創新計劃資助項目(No JCYJ20130329 155553734)

收稿日期:2015－03－09，修回日期:2015－03－27

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－0931－05

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.009