蛇床子素對機械性腦損傷小鼠的抗炎抗凋亡作用研究

孔　亮，姚瓔珈，教亞男，李少恒，陶震宇，閆宇輝，楊靜嫻(遼寧中醫藥大學藥學院藥理學教研室，遼寧大連　116600)

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蛇床子素對機械性腦損傷小鼠的抗炎抗凋亡作用研究

孔亮，姚瓔珈，教亞男，李少恒，陶震宇，閆宇輝，楊靜嫻
(遼寧中醫藥大學藥學院藥理學教研室，遼寧大連116600)

中國圖書分類號: R-332; R284.1; R322.81; R329. 25; R364. 5; R651. 150. 531

摘要:目的研究蛇床子素(osthole，Ost)對小鼠機械性腦損傷后細胞凋亡及炎癥細胞浸潤的影響。方法建立針刺傷小鼠機械性腦損傷模型，隨機分為假手術組、模型組、蛇床子素10、20、30 mg·kg－1治療組。主要檢測各組小鼠腦組織含水量; RT-PCR法檢測皮層損傷灶凋亡因子Bax，Bcl-2，活化半胱胺酸蛋白酶蛋白-3(Caspase-3)mRNA的表達變化;免疫組織化學染色法檢測損傷灶周圍中性粒細胞(MPO)及小膠質細胞(Iba-1)浸潤情況以及Caspase-3陽性細胞表達情況。結果蛇床子素20，30 mg·kg－1治療組能夠明顯降低腦組織含水量;提高Bax/Bcl-2比值，降低凋亡因子Caspase-3 mRNA表達;蛇床子素30 mg·kg－1治療組能夠明顯減少大腦皮層損傷灶周圍中性粒細胞及小膠質細胞的浸潤，并且明顯減少凋亡細胞數量。結論蛇床子素對開放性腦損傷的小鼠具有一定的治療作用，可能是通過減少炎癥細胞浸潤，并且減少細胞凋亡發揮治療作用。

關鍵詞:蛇床子素;腦損傷;神經功能;腦水腫;炎癥浸潤;細胞凋亡

網絡出版時間:2015－6－5 11:22網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.022.html

楊靜嫻(1963－)，女，博士，教授，博士生導師，研究方向:神經藥理學，通訊作者，Tel: 0411-87586009; E-mail: jingxianyang@ yahoo.com

機械性腦損傷是一種常見的中樞神經系統損傷性疾病，致死和致殘率非常高。近些年，機械性腦損傷患者正逐年增加，嚴重影響患者的工作能力及生活質量，給患者及家屬造成嚴重的精神及經濟壓力。機械性顱腦損傷的病理過程包括原發性損傷和繼發性損傷，原發性損傷是與外界直接作用導致;繼發性損傷包括炎癥反應、氧自由基的增多和神經元壞死凋亡等［1－2］。

近些年，中藥在中樞神經系統方面的作用越來越受到重視，有研究表明，氧化苦參堿能夠減少大鼠缺血性腦損傷后神經細胞凋亡，修復神經功能;山茱萸環烯醚萜苷能夠抑制大鼠創傷性腦損傷后炎癥因子的釋放，減輕了繼發性損傷［4］。近年來發現蛇床子素(osthole，Ost)在中樞神經系統中具有廣泛的藥理作用，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化以及神經營養作用［5－7］，但是Ost對創傷性腦損傷小鼠的抗炎抗凋亡作用，還未見報道。本實驗主要探討Ost對小鼠腦損傷后炎癥細胞浸潤及細胞凋亡的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動物昆明種小鼠，購于大連醫科大學實驗動物中心，許可證號: SCXK(遼): 2008-0002。

1.1.2試劑蛇床子素(中國藥品檢驗所，純度＞98%，批號:110822-200407); DMSO(Sigma公司); RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo); PCR Master Mix Kit(Thermo);冰凍切片包埋劑(美國櫻花);兔抗Caspase-3多克隆抗體、兔MPO多克隆抗體、兔抗Iba-1多克隆抗體(北京博奧森); Cy3標記驢抗兔IgG二抗、FITC標記羊抗兔IgG二抗(Jackson);抗熒光淬滅劑(碧云天);其他試劑均為國產分析純。

1.1.3儀器Ti-S型熒光顯微鏡(日本尼康公司); ST-5ND型腦立體定位儀(成都儀器廠); MG96G型PCR儀(杭州朗基);水平核酸電泳儀(Bio-Rad); 4100型凝膠成像系統(UVP); CM-1850型冰凍切片機(德國徠卡)。

1.2方法

1.2.1實驗分組將40只小鼠(體質量30 g±5 g)隨機分為5組，每組8只，分別為(1)假手術組(Sham);(2)模型組(SWI);(3)10 mg·kg－1蛇床子素組;(4)20 mg·kg－1蛇床子素組;(5)30 mg· kg－1蛇床子素組。

1.2.2開放性腦損傷模型的制備根據以往文獻報道的開放性腦刺傷模型的制備方法［8］，利用10%烏拉坦對小鼠腹腔注射麻醉，麻醉起效后，將其固定于腦立體定位儀中，消毒、切開頭皮、分離骨膜，確定損傷位點:距顱骨中線左側2 mm、人字縫前2 mm處。利用牙鉆將小鼠顱骨鉆開直徑約1. 5 mm的圓孔，但不傷及大腦皮層。利用直徑為1. 3 mm探針垂直插入腦組織中，為了減小誤差，控制腦立體定位儀進針手柄，使其進針速度與深度一致，深度為2 mm，停留30 min，然后拔出探針，止血，縫合切口，消毒。將損傷后的小鼠置于鼠籠中，待其蘇醒。假手術組只鉆孔，不刺傷皮層。損傷1 h后根據文獻記載的方式采用腹腔注射給藥(藥物濃度為1 g· L－1)［6］，每天1次; Sham組給予等量含DMSO(＜0. 1%)的蒸餾水，最后1次注射后4 h后處死小鼠，取腦。包埋，置于－20℃冰凍切片機中做連續冠狀切片，片厚8 μm。

1.2.3針刺傷開放性腦損傷模型評價方法利用神經功能缺損評分(neurological severity scores，NSS)對造模方法進行評價［9］，NSS評分包括了力量、運動、感知及平衡能力測評，NSS評分包含了評分大于6說明腦損傷模型制作成功。

1.2.4腦組織含水量的檢測取損傷后3 d的小鼠，根據文獻報道的腦組織含水量的檢測方法進行實驗［10－11］，將各組小鼠麻醉后取腦，將取好的腦組織沿中線分為兩部分，取損傷側腦組織置于錫箔紙上測量其重量(濕重)，將其置于烘箱中100℃24 h后測量重量(干重)。

腦組織含水量/% =(濕重－干重)/濕重×100%

1.2.5逆轉錄PCR檢測凋亡相關基因表達情況取蛇床子素治療7 d后各組小鼠腦組織，TRIzol法提取各組細胞總RNA，取各組總RNA 3μg，按照試劑盒說明書合成cDNA［12］。取2 μL cDNA為模板，按照RT-PCR試劑盒說明書進行體外擴增，DNA引物由北京賽諾科為生物科技有限公司合成，序列為內參β-actin上游引物: 5'-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3';下游引物: 5'-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'，Bcl-2上游引物: 5'-CGCTGGGAGAACAGGGTA-3';下游引物: 5'-GGGCTGGGAGGAGAAGAT-3'，Bax上游引物: 5'-CTGACATGTTTTCTGACGGC-3';下游引物: 5'-TCAGCCCATCTTCTTCCAGA-3'; Caspase-3上游引物: 5'-AGATACCGGTGGAGGCTGACT-3';下游引物: 5'-TCTTTCGTGAGCATGGACACA-3'。瓊脂凝膠電泳，凝膠成像儀拍照，Image J圖像分析系統進行分析。結果用相對光密度表示，相對光密度=光密度目的基因/光密度β-actin。

1.2.6免疫組織化學染色方法利用免疫組織化學染色法檢測MPO、Iba-1、Caspase-3細胞表達情況。將8 μm厚腦冰凍冠狀切片置于室溫晾干，PBS 洗; 4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗×3次; 1% Triton X-100透化30 min，PBS洗×3次;5% BSA封閉30 min;兔抗MPO、Iba-1、Caspase-3多克隆抗體(1∶150)4℃孵育過夜，次日滴加Cy3標記驢抗兔、FITC標記羊抗兔二抗(1∶300)室溫孵育1 h，DAPI染核15 min，滴加少量抗熒光淬滅劑，蓋玻片封片，置于熒光顯微鏡下觀察各組MPO、Iba-1、Caspase-3細胞的表達變化。

1.2.7統計學處理采用SPSS 13. 0統計軟件進行統計學分析，數據以±s表示，對所得數據進行單因素方差分析和t檢驗。

Tab 1　Comparison of neurologic severity score(NSS)in each group of mice

2　結果

2.1小鼠機械性腦損傷模型評價各組小鼠清醒后，分別于損傷后12 h進行NSS評分檢測，假手術組各只小鼠NSS評分少許增加，說明假手術對小鼠造成了輕微的神經損傷，其余各組小鼠清醒后均出現了不能行走或者偏癱、感知反射等能力喪失的現象，其余各組與假手術組相比，NSS評分明顯增加，見表1(P ＜0. 01)，并且各組NSS評分均大于6，說明機械性腦損傷模型制備成功，能夠用于以后的實驗。

2.2腦組織含水量為了驗證不同劑量的蛇床子素能否降低腦組織含水量，減輕水腫程度，我們于損傷后3 d進行了腦組織含水量的測定。結果顯示，SWI組與Sham組相比，腦組織含水量明顯增加(P＜0. 01)，20 mg·kg－1與30 mg·kg－1蛇床子素組腦組織含水量與SWI組相比，均能夠降低腦組織含水量，減少水腫，且差異具有顯著性(P＜0.05，P＜0. 01); 20 mg·kg－1與30 mg·kg－1蛇床子素組差異并沒有顯著性(P＞0. 05)。而10 mg·kg－1蛇床子素組則無明顯作用(P＞0. 05)。Sham組、SWI組、10、20、30 mg ·kg－1Ost組腦組織含水量分別為:(67. 36± 1. 39)%、(85. 27±2. 92)%、(80. 18±1. 85)%、(75. 89±1. 30)%、(74. 86±2. 87)%，見Fig 1。

Fig 1　Effect on brain water content with Ost treatment##P＜0. 01 vs sham group;*P＜0.05，＊＊P＜0. 01 vs SWI group

2.3 Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表達我們于損傷后7 d進行了RT-PCR實驗，檢測蛇床子素對腦組織損傷后凋亡的影響，結果顯示，SWI組與Sham組相比，凋亡因子Bax/Bcl-2 mRNA比率，caspase-3 mRNA表達量明顯增加(P＜0. 01)，20與30 mg·kg－1蛇床子素組與SWI組相比，均能夠降低Bax/Bcl-2 mRNA比率，caspase-3 mRNA表達量且差異具有顯著性(P ＜0. 05，P＜0. 01);20與30 mg·kg－1蛇床子素組并沒有顯著性差異(P＞0. 05)。而10 mg·kg－1蛇床子素組則無明顯作用(P＞0. 05)。Sham組、SWI組、10、20、30 mg·kg－1Ost組Bax/Bcl-2 mRNA比率分別為:(0. 34±0. 10)%、(1. 64±0. 20)%、(1. 26± 0. 12)%、(0. 78±0. 19)%、(0. 62±0. 18)%; Sham組、SWI組、10、20、30 mg·kg－1Ost組caspase-3 mRNA表達量分別為:(0. 24±0. 04)%、(0. 53± 0. 06)%、(0. 41±0. 06)%、(0. 35±0. 05)%、(0. 31± 0. 03)%，見Fig 2。

2.4 caspase-3表達情況我們于損傷后7 d利用免疫組織化學染色法，測定caspase-3陽性細胞數量，研究蛇床子素對機械性腦損傷小鼠的抗凋亡作用。結果顯示，SWI組與Sham組相比，caspase-3陽性細胞數量明顯增加(P＜0. 01)，30 mg·kg－1蛇床子素組與SWI組相比，能夠明顯降低caspase-3陽性細胞數量(P＜0.05)。Sham，SWI，30 mg·kg－1Ost組腦組織含水量分別為:(19.67±4.16)cells/mm2，(115.33± 17.21)cells/mm2，(64.00±4.58)cells/mm2，見圖3。

Fig 2　Effect of osthole on apoptotic cytokines mRNA in injuryed mice brains1: Sham; 2: SWI; 3: Ost 10 mg·kg－1; 4: Ost 20 mg·kg－1; 5: Ost 30 mg·kg－1.##P＜0. 01 vs sham group;*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs SWI group

Fig 3　Effect on apoptotic cytokine caspase-3 with Ost treatment##P＜0. 01 vs sham group;＊＊P＜0.01 vs SWI group

2.5 MPO及Iba-1表達情況為了研究蛇床子素是否能夠減輕腦損傷后傷口周圍炎癥細胞的浸潤現象，我們于損傷后3 d利用免疫組織化學方法檢測了損傷皮層中性粒細胞(MPO)，小膠質細胞(Iba-1)陽性細胞的表達情況。結果顯示，未損傷組MPO，Iba-1陽性細胞數量非常少，而SWI組與Sham組相比，MPO明顯增加(P＜0. 01)，30 mg· kg－1蛇床子素組與SWI組相比，能夠明顯減輕中性粒細胞浸潤情況，差異具有顯著性(P＜0. 01)。Sham組、SWI組、30 mg·kg－1Ost組MPO細胞數量分別為:(18. 83±6. 37)cells·mm－2、(290. 67± 34. 89)cells·mm－2、(176. 00±39. 48)cells· mm－2。損傷后Iba-1數量也明顯增加(P＜0. 01)，經30 mg·kg－1蛇床子素治療后其數量明顯降低(P ＜0. 01)。Sham組、SWI組、30 mg·kg－1Ost組Iba-1細胞數量分別為:(34. 67±10. 78)cells·mm－2、(247. 83±52. 29)cells·mm－2、(115. 33±47. 96)cells·mm－2，見圖4。

3　討論

蛇床子素是獨活和蛇床子等中藥的主要活性成分，屬于香豆素類化合物［13］。具有神經營養作用的中藥單體蛇床子素能夠保護由Aβ損傷的大腦皮層神經元;在實驗性自身免疫性腦脊髓炎動物模型中，蛇床子素能夠通過改善病處微環境，促進外源性NSCs存活與分化，促進髓鞘與軸突再生，并發揮神經營養等作用［14－15］。本實驗通過建立小鼠開放性腦刺傷模型，我們證實了這種模型制備方法能夠造成小鼠神經功能的損傷，能夠用于實驗。血腦屏障被破壞，腦內含水量升高，繼而導致腦水腫［16］，本實驗證明20、30 mg·kg－1蛇床子素能夠減輕損傷后腦組織含水量，有利于水腫的消除和血腦屏障的恢復。

細胞凋亡主要是線粒體損傷，導致線粒體功能改變或喪失，激活caspase凋亡級聯反應，最終導致凋亡［17］。Bcl-2家族基因是細胞內一種重要的抗凋亡因子，凋亡發生過程中，Bcl-2表達降低; Bax則是Bcl-2家族中一種促凋亡因子，Bcl-2和Bax基因可以形成二聚體，當Bcl-2表達量多時抑制細胞凋亡，當Bax表達多時促進細胞凋亡。本實驗證實20、30 mg·kg－1蛇床子素能夠降低損傷后腦組織內Bax/Bcl-2的比率及caspase-3 mRNA的表達，并且30 mg ·kg－1蛇床子素能夠減少caspase-3陽性細胞的數量，因此蛇床子素能夠抑制損傷后神經細胞的凋亡。

腦損傷導致的炎癥反應可能會引起并加重繼發性腦損傷，如中性粒細胞浸潤會導致腦水腫，形成惡性循環［18］。中性粒細胞及小膠質細胞是腦損傷發生后比較常見的炎癥細胞，所以本實驗利用免疫組織化學染色法檢測了腦內MPO、Iba-1的表達量，結果發現，腦損傷后腦內MPO、Iba-1的表達量明顯增多，當給予蛇床子素后腦內MPO、Iba-1的表達量明顯減少，炎癥細胞浸潤現象減輕。這充分說明了蛇床子素對炎癥反應的抑制作用，也進一步證明了蛇床子素通過減輕炎癥因子和炎癥反應而減輕腦損傷程度。

綜上所述，蛇床子素可以減輕小鼠機械性腦損傷，并且證實蛇床子素發揮的治療作用是通過抑制細胞凋亡，抑制炎癥細胞，減輕炎癥反應，發揮治療作用。為有效修復治療腦損傷等神經系統難治性疾病開辟新的思路與途徑，具有廣闊的臨床應用前景和重大的社會經濟價值。

(以上實驗內容在遼寧中醫藥大學藥學院藥理實驗室完成)。

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Anti-apoptosis and anti-inflammatory effect of osthole in mice following stab wound injury

KONG Liang，YAO Ying-jia，JIAO Ya-nan，LI Shao-heng，TAO Zhen-yu，YAN Yu-hui，YANG Jing-xian
(Dept of Pharmacology，School of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian Liaoning 116600，China)

Abstract:Aim To investigate the effects of osthol on cell apoptosis and inflammatory cell infiltration after brain stab wound injury in mice.Methods The mice underwent the stab wound injury by a needle，thenwere randomly divided into sham operation group，model group，osthol 10，20，30 mg·kg－1treatment group.The main examinations included mice brain water content; the apoptotic cytokines Bax，Bcl-2，Caspase-3 mRNA expression were assessed by PTPCR; immunohistochemistry staining was used to detect neutrophils(MPO)and microglia(Iba-1)infiltration and Caspase-3 positive cell expression around injured lesions.Results Treatment with osthole 20，30 mg·kg-1group significantly reduced the water content in injured brain，improved the ratio of Bax/Bcl-2，and reduced the expression of apoptosis cytokine Caspase-3 mRNA.Osthole 30 mg·kg－1treatment group obviously reduced the infiltration of neutrophils and microglial cells and significantly reduced the number of apoptotic cells around the injured cerebral cortex.Conclusion Osthole has therapeutic effect on stab wound injury in mice，and the possible mechanism may be by reducing the infiltration of inflammatory cells and reducing apoptotic cells.

Key words:osthole; stab wound injury; neural function; brain edema; inflammatory infiltration; cell apoptosis

作者簡介:孔亮(1990－)，男，碩士生，研究方向:中藥神經藥理學，E-mail: 13998418026@163.com;

基金項目:國家自然科學基金面上項目(No 81173580)

收稿日期:2015－03－02，修回日期:2015－04－01

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－0999－06

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.022