右美托咪定在大鼠脊髓缺血再灌注損傷中的保護作用及機制研究

江亞楠 梁永新，施彩鳳 孫一笑 李少娜

摘 要：目的 探討右美托咪定對大鼠脊髓缺血/再灌注損傷的保護作用及PI3K/Akt傳導通路在其中的作用。方法 30只成年雄性大鼠隨機分為假手術組、模型組和右美托咪定治療組，每組10只。建立大鼠脊髓缺血/再灌注損傷模型，對再灌注損傷后6 h、12 h、24 h、48 h實驗大鼠后肢運動功能進行評分，檢測缺血脊髓前角組織中P-AKT的表達水平及神經元的凋亡指數。結果 右美托咪定可改善脊髓缺血/再灌注損傷后實驗大鼠的后肢運動功能（P<0.05）；提高脊髓前角P-AKT的表達水平（P<0.05），抑制缺血/再灌注損傷所致的脊髓神經元的凋亡（P<0.05）。結論 右美托咪定對脊髓缺血/再灌注損傷有一定的保護作用，其機制可能與激活PI3K/Akt傳導通路，從而抑制神經元的凋亡有關。

關鍵詞：右美托咪定； 再灌注損傷；細胞凋亡；脊髓； PI3K/Akt

中圖分類號：R614 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.07.022

文章編號：1006-1959（2018）07-0069-03

Protective Effects and Mechanism of Dexmedetomidine on Spinal Cord Ischemia-Reperfusion Injury in Rats

JIANG Ya-nan，LIANG Yong-xin，SHI Cai-feng，SUN Yi-xiao，LI Shao-na

（Department of Anesthesiology，Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao 266003，Shandong，China）

Abstract：Objective To investigate the protective effect of dexmetomidine on spinal cord ischemia/reperfusion injury in rats and the role of PI3K/Akt pathway in it.Methods 30 adult male rats were randomly divided into the sham operation group，the model group and the right metomomidine treatment group，with 10 rats in each group.A rat model of spinal cord ischemia/reperfusion injury was established.The hindlimb motor function was scored at 6 h，12 h，24 h，and 48 h after reperfusion，and the expression of P-AKT in the anterior horn of ischemic spinal cord was detected.Levels and neuronal apoptosis index.Results Dexmedetomidine can improve the hindlimb motor function in rats after spinal cord ischemia/reperfusion injury（P<0.05），increase the expression level of P-AKT in the anterior horn of spinal cord（P<0.05），and inhibit the apoptosis of spinal cord neurons induced by ischemia/reperfusion（P<0.05）. Conclusion Dexmedetomidine has a protective effect on spinal cord ischemia/reperfusion injury，and its mechanism may be related to activation of PI3K/Akt conduction pathway and inhibition of neuronal apoptosis.

Key words：Dexmetomidine；Reperfusion injury；Apoptosis；Spinal cord；PI3K/Akt

脊髓供血動脈本身疾患、主動脈手術、脊髓內顯微外科手術均可引起脊髓缺血再灌注損傷（reperfusion injury，RI），一般預后較差，致殘率很高。右美托咪定（DEX）是一種高選擇性的α2腎上腺素受體激動劑，對中樞神經有很多作用，比如鎮靜、鎮痛和麻醉藥節儉作用。有研究表明DEX可以改善大鼠短暫缺血腦組織的損傷[1，2]，其機制可能與抑制神經元凋亡有關[3]。本研究采用大鼠腹主動脈阻斷建立脊髓RI模型，探討右美托咪定對脊髓RI的保護作用及其機制，為臨床應用提供實驗依據。

1材料與方法

1.1一般材料 清潔級健康成年雄性Wistar大鼠30只，體質量250～300 g，由青島市動物實驗中心提供；鹽酸右美托咪定為江蘇新晨制藥有限公司提供，（批號H20091256）；P-AKT抗體由北京博奧森生物技術有限公司提供；原位細胞死亡檢測試劑盒（TUNEL）由武漢博士德公司提供。

1.2方法

1.2.1 實驗分組 隨機分為3組， A 組：假手術組10例，打開腹腔將腹主動脈暴露，然后關閉腹腔；B組：模型組10例，阻斷腹主動脈，30 min后，將腹主動脈開放再灌注； C組：DEX處理組10例，阻斷腹主動脈，30 min后將腹主動脈開放再灌注，關閉腹膜前DEX （10 μg/kg）腹腔內注射。

1.2.2動物模型 采用Zivin[3]法復制大鼠脊髓RI模型： 2%戊巴比妥鈉40 mg/kg體質量腹腔麻醉，腹正中切口，在無菌條件下打開腹腔，暴露腹主動脈，手術分離腹主動脈至腎動脈水平，用無創傷血管夾在腎動脈起始部遠端將腹主動脈夾閉，阻斷脊髓血供。30 min后移去血管夾，使脊髓血液再灌注，關閉腹腔，即制成脊髓RI模型。術后常規給予青霉素40萬單位肌肉注射，2次/d。

1.2.3 神經功能評分 再灌注6 h、12 h、24 h和48 h，由一名對分組情況不知曉的觀察者對大鼠后肢神經功能進行評分。評估標準依據Behrmann （1993） 5點分級法[4]評價大鼠后肢功能。

1.2.4脊髓組織P-AKT的表達及神經元細胞凋亡的檢測 再灌注48 h后取L5部位脊髓前角灰質進行檢測。采用抗P-AKT多克隆抗體進行免疫組化染色，并采用評分量化表[5]來評價各實驗組P-AKT的表達程度。評分標準：0（無表達）、1（陽性）、2（強陽性）。另用末端脫氧核苷酸轉移酶（terminal deoxyribonucleotidyl transferase， TdT）介導的帶生物素dUTP缺口末端標記（TdTmediated dUTPbiotin nick end labeling， TUNEL）法原位檢測缺血再灌注后脊髓組織細胞凋亡的情況，以神經元細胞核染色呈黃色或棕黃色時即為陽性，以凋亡指數（apoptosis index，AI）作為評定標準。凋亡指數判定：每張脊髓組織切片中至少1000個細胞中出現的凋亡細胞的百分數。

1.3統計學處理 本次研究數據采用SPSS 13.0統計軟件統計分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗判定各實驗組與相應對照組間差異顯著性；等級資料采用wilcxon秩和檢驗；評分給出各分值的例數，組間比較采用非參數（Kruska-Walis）檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1右美托咪定對神經運動功能的影響 假手術組實驗大鼠后肢運動功能無異常。模型組和右美托咪定治療組實驗大鼠于缺血再灌注后均出現不同程度的癱瘓。右美托咪定治療組實驗大鼠后肢運動功能的恢復情況要優于模型組（P<0.05），見表1。

2.2 脊髓神經元P-AKT表達程度 實驗結果表明，DEX組P-AKT表達水平強于其它兩組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 脊髓神經元凋亡指數的比較 空白對照組脊髓組織未見神經元凋亡，模型組脊髓組織可見大量凋亡神經元。DEX組凋亡神經元較模型組減少，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

3討論

既往認為，脊髓缺血后神經元的死亡方式為缺血壞死。但近年來研究認為，細胞凋亡可能是脊髓缺血后神經元死亡的主要方式[6]。細胞凋亡，是指機體細胞在發育過程中或在某些因素作用下，通過細胞內基因及其產物的調控而發生的一種程序性細胞死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程。細胞凋亡形態學變化的基本特征是：細胞質凝聚，細胞核濃縮，凋亡小體形成。大鼠脊髓缺血再灌注損傷后6 h出現神經元的凋亡，24 h達到高峰，主要出現在脊髓前、后角[7]。常規組織切片染色不易檢測出凋亡細胞，而TUNEL法是生物素標記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3'-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的鏈霉親和素streptavidin特異性結合，后者又與POD底物H2O2、二氨基聯苯胺（DAB）產生深棕色反應，特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在光學顯微鏡下即可觀察凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL法敏感性和特異性極高，是目前國際上公認的檢測凋亡細胞的手段[8]。

細胞凋亡所涉及的因素及信號傳導途徑非常復雜。最近的研究表明，PI3K / Akt信號通路是細胞重要的生存信號，其激活對保護神經元免受缺血和缺氧損傷至關重要[9-11]。PI3K / Akt信號通路也是膜受體信號轉導入細胞的主要途徑，可以在維持細胞存活和抑制細胞凋亡中發揮重要作用。通過影響細胞凋亡相關蛋白，細胞周期控制蛋白的激活過程，抑制細胞凋亡和促進細胞增殖[12，13]。PI3K可被細胞外信號激活，如酪氨酸激酶受體，非酪氨酸激酶受體，胰島素受體，活化的PI3K位于細胞膜中，可進一步激活一系列下游蛋白激酶，如PKA，AKT和PKC，并調控多種病理生理過程，包括增殖，凋亡，遷移和惡性轉化。Akt是PI3K信號通路中的下游靶標激酶之一。當細胞被細胞外信號刺激時，活化的PI3K可產生PIP3，其可與Akt的PH結構相互作用，將Akt轉移到細胞膜并將其激活成p-Akt，從而增加信號通路的級聯反應調節凋亡[14]。AKT也可以對凋亡通路上的其他因子進行磷酸化、抑制細胞凋亡、促進細胞生存。腦缺血再灌注后，通過激活PI3K-AKT通路可減少神經元凋亡，起到神經保護作用。

有研究證實，DEX可以通過PKCα和CREB信號通路激活星形膠質細胞分泌GDNF[15]，而后者可以改善損傷后神經元的恢復。本次研究發現，大鼠脊髓RI后，模型組脊髓前角神經元內P-AKT表達強假手術組，表明脊髓發生缺血再灌注損傷后，機體內存在抗細胞凋亡的自我保護機制；與模型組比較，DEX組P-AKT表達水平增高，脊髓神經元凋亡減少，可見DEX可以抑制缺血再灌注后脊髓神經元的凋亡，其機制可能與激活PI3K-AKT通路有關。

本研究表明，DEX可以抑制大鼠脊髓RI后神經元的凋亡，提高再灌注后大鼠后肢6，12，24，48 h的神經功能評分，表明DEX對大鼠脊髓缺血RI有保護作用，其機制可能是DEX刺激脊髓星形膠質細胞分泌GDNF，而后者激活了PI3K-AKT通路，從而抑制了脊髓RI后神經元的凋亡。

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收稿日期：2017-11-23；修回日期：2018-1-21

編輯/李樺