姜黃素對大鼠慢性腦缺血誘發(fā)腦損傷的保護(hù)作用及分子機(jī)制研究

楊 柳，張 敏，賀 曦，朱 潔，王進(jìn)平，孟 濤

（重慶市急救醫(yī)療中心神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400014）

姜黃素對大鼠慢性腦缺血誘發(fā)腦損傷的保護(hù)作用及分子機(jī)制研究

楊 柳，張 敏，賀 曦，朱 潔，王進(jìn)平，孟 濤

（重慶市急救醫(yī)療中心神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400014）

目的觀察姜黃腦素對缺血后海馬組織中細(xì)胞色素C以及caspase-3蛋白的表達(dá)情況，探討姜黃素發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。方法將50只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham）、正常對照組、缺血后二甲基亞砜（DMSO）干預(yù)對照組、姜黃素高劑量組（100 mg／kg）和姜黃素低劑量組（50 mg／kg）。所有治療組于術(shù)后24 h開始以姜黃素每日腹腔注射，連續(xù)28 d。給藥結(jié)束后，對各組進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)測試大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力，然后處死大鼠，用HE染色和尼氏染色觀察海馬組織的病理形態(tài)變化，Western-Blot法檢測海馬組織中細(xì)胞色素C和capase-3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果與各對照組比較，姜黃素明顯增強(qiáng)了慢性腦缺血大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，而且明顯減輕了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。Western-Blot法檢測到姜黃素使海馬組織中細(xì)胞色素 C和caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05）。結(jié)論姜黃素對慢性大腦缺血誘發(fā)腦損傷有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過細(xì)胞色素C途徑抑制caspase-3蛋白的表達(dá)而發(fā)揮作用。

姜黃素；慢性腦缺血；細(xì)胞色素C；細(xì)胞凋亡

血管性癡呆（VD）是老年人群常見的癡呆類型之一，是一類與腦血管因素有關(guān)的癡呆，通常以各種腦血管疾病導(dǎo)致腦組織損傷引起的認(rèn)知功能障礙為臨床特征。目前認(rèn)為，慢性腦血流灌注不足引起的腦缺血缺氧是誘發(fā)VD發(fā)生的重要原因[1]。而在慢性腦缺血過程中，神經(jīng)元的凋亡對損傷腦組織發(fā)揮著重要的作用，是引起VD認(rèn)知功能障礙的重要機(jī)制[2]。因此，研究和尋找安全有效的抗凋亡藥物具有很強(qiáng)的現(xiàn)實(shí)意義。姜黃素（curcumin）是一種黃色粉末狀的天然植物化合物，是由植物姜黃的根莖中提取，已被證實(shí)具有抗炎癥[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤[5]等多種生物學(xué)效應(yīng)，而對正常組織細(xì)胞幾乎無毒性[6]。近年來已有研究證實(shí)，姜黃素具有抗大鼠腦缺血損傷的作用，但多數(shù)研究集中于其對急性腦缺血-再灌注導(dǎo)致腦損傷的保護(hù)作用和機(jī)制，對其在慢性腦缺血損傷中的作用及相關(guān)機(jī)制尚不清楚。因此，本研究中擬通過建立慢性腦缺血的大鼠模型，并觀察姜黃素對慢性腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用，從而探討姜黃素可能的保護(hù)機(jī)制，并為防治VD提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 材料

動物：SPF級Sprague-Dawley大鼠，雄性，體重200～300 g，

由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證號為 SCXK（渝）2007-0001]；試驗(yàn)開始前將大鼠置室溫恒定（20～25℃）的實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)7～10 d，給予充足的普通飼料和水，飲食自由攝取；造模手術(shù)開始前禁食12 h，可自由飲水。

試藥：姜黃素購自美國Sigma公司，稱取10 mg，用二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）溶解，形成母液；PRO-PREPTM蛋白提取液購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；SDS-PAGE凝膠配置試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；Page RulerTMPrestained Protein ladder來自美國 Fermentas公司；PVDF膜購自美國 Millipore公司。Cyto C和 caspase-3兔抗大鼠一抗來源于 Cell Signaling公司；內(nèi)參兔抗β-actin抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗均來自北京博鰲森生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光試劑盒購自美國Bio-rad公司。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 動物分組與藥物處理

選用SPF級Sprague-Dawley大鼠50只，雄性，體重200～300g，將其隨機(jī)分為5組，即正常對照組（A組）、假手術(shù)組（B組）、缺血后 DMSO干預(yù)對照組（C組）、藥物治療組（D組），D組又分為高劑量組（D1組，100 mg／kg）和低劑量組（D2組，50 mg／kg），每組10只。D組于術(shù)后24 h開始以100 mg／kg和50 mg／kg的劑量腹腔注射姜黃素。A組、B組、C組用等量的DMSO腹腔注射，每日1次，不間斷給藥28 d。

1．2．2 慢性腦缺血模型制備（2VO式）

采用 Liu等[7]介紹的經(jīng)典方法復(fù)制大鼠慢性腦缺血模型[7]。造模手術(shù)開始前大鼠禁食12 h，可自由飲水。用3．5%水合氯醛（350 mg／kg）腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉成功后，將大鼠仰臥固定，頸部備皮并消毒，用無菌手術(shù)器械沿頸正中切開皮膚及皮下組織，長度約1．5 cm，暴露頸部肌肉，分別沿兩側(cè)頸前肌肉和側(cè)方肌肉間隙鈍性分離雙側(cè)頸總動脈，分別結(jié)扎兩側(cè)頸總動脈，結(jié)扎血管后間斷縫合皮膚，縫合完畢，酒精消毒切口，完成慢性腦缺血模型。B組只分離雙側(cè)頸總動脈而不結(jié)扎，其余過程相同。

1．2．3 Morris水迷宮試驗(yàn)

空間定位航行試驗(yàn)：于各組大鼠給藥28 d后進(jìn)行。參照水迷宮原理[8]，試驗(yàn)共測試5 d。從第1天到第5天，試驗(yàn)開始前允許先將大鼠放在平臺上停留20 s，然后每天將大鼠分別從Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ象限的固定入水點(diǎn)入水，入水時(shí)使大鼠背對水池壁緩慢放入水中，防止其看到水下平臺位置。入水的同時(shí)由攝像機(jī)連接電腦，記錄2 min內(nèi)大鼠找到平臺的時(shí)間（即逃避潛伏期）、路程和游泳速度。大鼠找到平臺并爬上平臺停留3 s及3 s以上，電腦系統(tǒng)自動停止計(jì)時(shí)，此時(shí)該象限試驗(yàn)結(jié)束。若大鼠在2 min內(nèi)仍沒有找到平臺，則將其逃避潛伏期計(jì)為2 min，并引導(dǎo)該大鼠找到平臺同時(shí)在平臺上停留15 s。

空間探索試驗(yàn)：第5天做完空間定位航行試驗(yàn)后撤去水下平臺，將大鼠從第Ⅲ象限的入水點(diǎn)放入水中，記錄其穿越原平臺所在位置的次數(shù)和原平臺所在象限的路程（即軌跡）長度。

1．2．4 形態(tài)學(xué)檢測

HE染色：取經(jīng)石蠟包埋切片后的腦組織切片，依次作二甲苯透明、酒精脫水、蘇木素染色、鹽酸酒精分化、伊紅染色、酒精脫水、二甲苯透明等操作，用中性樹膠封片。

尼氏染色：腦組織切片按以上過程常規(guī)脫蠟，將脫蠟好的切片用蒸餾水沖洗后浸入1%的甲苯胺藍(lán)溶液中，室溫下浸染30 min；切片置蒸餾水中沖洗，以酒精梯度脫水、二甲苯透明，最后以中性樹膠封片。

1．2．5 Western-Blot法檢測

將處死后大鼠的海馬組織迅速取出，加入組織裂解液，碾磨、勻漿、離心后取上清，應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，以20 μL樣品上樣，行10%SDS-聚丙酰胺凝膠電泳（保證樣品的含量基本一致），然后將電泳蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液室溫下封閉1 h，加入cyto C（1∶2000），caspase-3（1∶2 000）以及β-actin（1∶500）4℃孵育過夜，加二抗（1∶1 000）室溫下孵育2～3 h，顯色，曝光洗片。以 β-actin作為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)分析各條帶吸光度值，計(jì)算各條帶與內(nèi)參條帶的吸光度比值作為蛋白半定量分析結(jié)果。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11．5軟件對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均以表示，兩樣本間均數(shù)比較采用SNK-q檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 Morris水迷宮試驗(yàn)

結(jié)果見表1及圖1。經(jīng)過連續(xù)5 d的訓(xùn)練，盡管處理方式不同，但各組大鼠逃避潛伏期隨訓(xùn)練次數(shù)的增加均呈縮短趨勢（圖1A），說明大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力可伴隨訓(xùn)練次數(shù)增加而增強(qiáng)。第5天試驗(yàn)結(jié)果顯示，缺血后C組大鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯高于B組和A組（P＜0．05），表明慢性缺血后大鼠的空間學(xué)習(xí)能力顯著下降；姜黃素治療后，與C組比較，大鼠的空間學(xué)習(xí)能力明顯得到提高，且呈劑量依賴性（P＜0．05）。為了進(jìn)一步觀察姜黃素對慢性腦缺血大鼠記憶能力的影響，記錄了大鼠在原平臺所在象限停留時(shí)間占總游泳時(shí)間的比例，見圖1B。結(jié)果顯示，C組在原平臺所在象限停留時(shí)間占總游泳時(shí)間的比例明顯少于B組和A組（P＜0．05），而D1組和D2組則比C組顯著延長（P＜0．05），表明姜黃素可增強(qiáng)慢性腦缺血大鼠的記憶能力。

表1 Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果（，s，n=10）

表1 Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果（，s，n=10）

組別A組B組C組D1組D2組給藥DMSO等量DMSO等量DMSO等量姜黃素100 mg／kg姜黃素50 mg／kg逃避潛伏期12．83±8．61 14．73±3．73 76．82±2．31 22．29±3．41 33．90±5．42

圖1 姜黃素對術(shù)后大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的影響

2．2 形態(tài)學(xué)檢測

慢性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ徒⒑螅cA組和B組比較，HE染色顯示海馬CA1區(qū)大量壞死或凋亡的神經(jīng)元，錐體細(xì)胞也明顯丟失，細(xì)胞排列紊亂，極為不規(guī)則，可見細(xì)胞核大量皺縮，膠質(zhì)細(xì)胞也明顯增生（圖2），尼氏染色顯示尼氏小體明顯丟失（圖3）；而姜黃素處理后，海馬CA1區(qū)的異常形態(tài)學(xué)改變得到明顯改善，壞死及凋亡的神經(jīng)元明顯減少，細(xì)胞排列規(guī)整，細(xì)胞核形態(tài)正常，膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，健存的神經(jīng)元和尼氏小體數(shù)量也較多，形態(tài)完整。

2．3 Western-Blot法檢測

結(jié)果見圖4和圖5。與A組和 B組比較，慢性腦缺血大鼠模型建立后，海馬組織內(nèi)cyto C和caspase-3蛋白的表達(dá)水平都顯著升高（P＜0．05）；經(jīng)不同劑量的姜黃素處理28 d后，海馬組織中cyto C和caspase-3蛋白的表達(dá)水平明顯受到抑制，且抑制作用隨姜黃素的劑量增加而增強(qiáng)，呈濃度依賴性（P＜0．05）。

3 討論

細(xì)胞凋亡作為基本的生命現(xiàn)象，在維持機(jī)體自身穩(wěn)定中起著重要作用，現(xiàn)階段對其的研究已涉及到生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，具有十分重要的生物學(xué)意義。眾所周知，半胱氨酸蛋白酶家族（caspases）是特異性凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，它的激活被認(rèn)為是凋亡發(fā)生機(jī)制中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。caspase酶原本身沒有活性，必須通過活化才能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。線粒體依賴途徑則是激活 caspase的主要途徑：當(dāng)受到細(xì)胞凋亡信號刺激時(shí)，線粒體釋放細(xì)胞色素C（cytochrome c，Cyto C）至細(xì)胞漿中；Cyto C與細(xì)胞內(nèi)存在的一種凋亡細(xì)胞蛋白酶激活因子（apoptosis protease activating factor-1，apaf-1）結(jié)合，在dATP存在的條件下，發(fā)揮其促使細(xì)胞凋亡的作用。參與凋亡的caspases包括兩類：一類是凋亡啟動組，包括caspase-2，8，9，10等；凋亡執(zhí)行組，包括 caspase-3，6，7等。其中caspase-3是最重要的凋亡執(zhí)行者之一，參與凋亡途徑的最后執(zhí)行階段，完成致命性的DNA斷裂，直接參與凋亡形態(tài)學(xué)和生化特征的形成。

圖2 姜黃素對受損海馬CA1區(qū)錐體層細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響（HE染色）

圖3 姜黃素對受損海馬CA1區(qū)錐體層細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的影響（尼氏染色）

圖4 姜黃素對受損大鼠海馬組織內(nèi)cyto C蛋白表達(dá)水平的影響

圖5 姜黃素對受損大鼠海馬組織內(nèi)caspase-3的影響

VD是老年性癡呆的常見類型，且往往合并阿爾茨海默病（AD），VD的存在可加重AD患者的病情。從對VD的治療和預(yù)防角度而言，對VD的研究要比AD更有實(shí)際價(jià)值和意義，故目前許多國內(nèi)外學(xué)者將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到VD上來。各種腦血管疾病誘發(fā)的腦血流灌注不足是引起VD發(fā)生的主要原因。由于腦灌注不足且不能及時(shí)恢復(fù)正常，導(dǎo)致腦血流量減少，引起腦組織中葡萄糖、活性氧及其他代謝產(chǎn)物的量出現(xiàn)異常，從而造成缺血區(qū)域神經(jīng)元的死亡。在各種實(shí)驗(yàn)性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭幸呀?jīng)證實(shí)，凋亡是缺血后神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要形式。因此，抑制與細(xì)胞凋亡相關(guān)的caspases活性，可能對于治療VD有很高的現(xiàn)實(shí)意義和社會價(jià)值。

本研究中，采用永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈的方法來建立慢性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ汀suchiya等[9]的研究顯示，采用該方法2．5 h后，大鼠腦血流量立即銳減25% ～87%，1周后由于大鼠腦血管交通支的建立以及其代償功能，腦血流量又恢復(fù)到術(shù)前正常時(shí)的60% ～75%，并長期維持在這一水平。因此，采用該方法建立的模型更接近人類患病的情況，可將其用于研究因慢性腦缺血導(dǎo)致VD的發(fā)病機(jī)制和相關(guān)治療藥物的篩選。

姜黃素作為咖喱、食品添加劑及傳統(tǒng)中藥姜黃的主要活性成分，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，且毒性低、安全有效，開發(fā)前景廣闊，備受國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的密切關(guān)注。Jing等[10]發(fā)現(xiàn)，姜黃素對局部以及全腦的缺血腦組織均有保護(hù)作用。Zhao等[11]發(fā)現(xiàn)，在急性缺血-再灌注的大鼠模型中，姜黃素可通過抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮腦保護(hù)作用。然而，關(guān)于姜黃素對慢性腦缺血的保護(hù)作用及其機(jī)制卻尚未見報(bào)道。

本研究中通過腹腔注射不同劑量的姜黃素以觀察其對慢性腦缺血-再灌注大鼠模型的作用，結(jié)果顯示，與DMSO處理組大鼠比較，姜黃素處理后能明顯縮短大鼠逃避潛伏期，延長大鼠在原平臺所在象限的停留時(shí)間，且這種效應(yīng)隨著姜黃素濃度的增加而逐漸提高，表明姜黃素能明顯改善模型大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。形態(tài)學(xué)檢測HE染色及尼氏染色結(jié)果也顯示，姜黃素能明顯減輕模型大鼠海馬CA1區(qū)組織中異常的形態(tài)學(xué)變化，提示姜黃素對慢性腦缺血誘發(fā)的腦損傷也有神經(jīng)保護(hù)作用。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，姜黃素能降低海馬組織中凋亡激活通路中重要的因子cyto C和凋亡執(zhí)行的重要因子capsase-3蛋白表達(dá)的水平，且呈劑量依賴效應(yīng)。

綜上所述，姜黃素對慢性腦缺血導(dǎo)致的VD也具有腦保護(hù)作用，而抑制 cyto C和caspase-3的表達(dá)，抗缺血后神經(jīng)元的凋亡可能是其保護(hù)作用機(jī)制之一。由于姜黃素還具有多方面的藥理學(xué)作用，其抗凋亡機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

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Protective Effects of Curcumin on Brain Injury Induced by Chronic Cerebral Ischemia in Rats and Its M olecular M echanism

Yang Liu，Zhang Min，He Xi，Zhu Jie，Wang Jinping，Meng Tao
（Department of Neurology，Chongqing Emergency Medical Center，Chongqing，China 400014）

Objective To observe the effects of curcumin on the expression of cytochrome C and caspase-3 protein in the hippocampus tissue after ischemia，and to explore the potential mechanism for curcumin playing its neuroprotection role．M ethods 50 Sprague-Dawley rats were randomly divided into the sham-operation group(Sham)，normal control group，bilateral common carotid occlusion（2VO）+ dimethyl sulfoxide（DMSO）intervention control group，curcumin high dose group（100 mg／kg）and curcumin low dose group（50 mg／kg）．All treatment groups were intraperitoneally injected by curcumin with in 24 h after operation for consecutive 28 d．Each group was performed the Morris water maze test for detecting the spatial learning and memory ability after medication．Then the rats were killed and the pathological morphological changes of hippocampus were observed by the hematoxylin and eosin（HE） staining and Nissl staining．Western-Blot was used to detect the expression of cytochrome C and caspase-3 in the hippocampus tissue．Results Compared to the various control groups，curcumin significantly enhanced the spatial learning and memory ability in the chronic ischemic rats and obviously alleviated the apoptosis of nerve cells．The Western-Blot detection showed that curcumin significantly decreased the expression levels of cytochrome C and caspase-3 protein in the hippocampus tissue（P＜0．05）．Conclusion Curcumin has obviously neuroprotective effect on the brain injury induced by chronic cerebral ischemia，its mechanism could be that curcumin might inhibit caspase-3 protein expression through cytochrome C pathway．

curcumin；chronic cerebral ischemia；cytochrome C；cell apoptosis

R285．5；R282．71

A

1006－4931(2015)04－0031－04

楊柳（1979-），碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科工作，(電話)023-63692355；張敏，大學(xué)本科，主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科工作，(電話)023-63692353。

2014－03－20；

2014－09－26)