姜黃素通過抑制糖皮質激素受體促進大鼠神經干細胞增殖

馬曉曉, 王春滿, 張高龍, 左春龍, 黃意湘, 劉 勁, 連慶泉, 林 函

(溫州醫科大學附屬第二醫院麻醉科, 浙江 溫州 325000)

姜黃素通過抑制糖皮質激素受體促進大鼠神經干細胞增殖

馬曉曉, 王春滿, 張高龍, 左春龍, 黃意湘, 劉 勁, 連慶泉, 林 函

(溫州醫科大學附屬第二醫院麻醉科, 浙江 溫州 325000)

目的 探討姜黃素對大鼠神經干細胞增殖的影響及其可能機制。方法 取孕15 d(E15)遠交群(SD)大鼠的胎腦皮質，分離培養原代神經干細胞，進行神經干細胞標志蛋白神經上皮干細胞蛋白巢蛋白(nestin)和胚胎干細胞關鍵蛋白(SOX2)染色鑒定。姜黃素 0，0.1，0.5，2.5，12.5和62.5 μmol·L-1處理大鼠神經干細胞24 h后，乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測細胞毒性；MTT法檢測細胞存活；5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)增殖試劑盒檢測神經干細胞增殖；熒光定量聚合酶鏈反應法(qRT-PCR)檢測神經干細胞糖皮質激素受體(GR)、信號轉導與激活因子3(Stat3)、Notch1和p21 mRNA表達；Western蛋白印跡法檢測神經干細胞GR, Stat3和磷酸化Stat3(p-Stat3)蛋白表達。結果 原代細胞經巢蛋白和SOX2蛋白染色鑒定為神經干細胞。LDH釋放法檢測結果顯示，姜黃素12.5和62.5 μmol·L-1對神經干細胞具有細胞毒性作用(P<0.05)。MTT結果顯示，姜黃素0.5和2.5 μmol·L-1增強神經干細胞活力，姜黃素62.5 μmol·L-1降低神經干細胞活力(P<0.05)。BrdU結果顯示，姜黃素0.1，0.5和2.5 μmol·L-1促進神經干細胞增殖(P<0.05)，姜黃素12.5和62.5 μmol·L-1抑制神經干細胞增殖(P<0.05)。qRT-PCR結果顯示，姜黃素0.5 μmol·L-1組GR mRNA表達明顯降低(P<0.05)。Western蛋白印跡法結果表明，姜黃素0.5 μmol·L-1組GR, Stat3和p-Stat3蛋白表達明顯降低(P<0.05)。結論 姜黃素促進神經干細胞增殖，可能與其抑制GR mRNA轉錄及相關蛋白表達有關。

姜黃素; 神經干細胞; 細胞增殖; 受體, 糖皮質激素

姜黃素(curcumin)能緩解阿爾茨海默病(Alzheimer disease, AD)模型小鼠的病理癥狀，改善和提高AD大鼠與老年小鼠的空間學習和記憶能力[1-2]；對岡田酸引起的小鼠記憶損傷具有神經保護作用[3]；阻止大鼠慢性乙醇中毒引起的認知功能障礙的發生[4]；并逆轉皮質酮引起的大鼠抑郁行為[5]。在離體細胞水平，姜黃素裝載的納米顆?？烧T導成年神經再生[6]；保護AD中神經元免受氧化應激的損傷，通過減弱氧化損傷作用保護皮質神經元[7-8]；還可以預防皮質酮引起的神經毒性和神經可塑性的異常[9]。由于神經干細胞(neural stem cell, NSC)在神經修復與再生中起重要作用，姜黃素對NSC的作用及其機制研究值得探討。Kim等[10]發現，姜黃素促進NSC的增殖，并且激活胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和P38激酶，但其中ERK和P38信號通路的具體作用機制仍不明確。另有研究表明，糖皮質激素通過糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor, GR)可抑制NSC的增殖[11]。離體及在體實驗證明，GR激活ERK和P38信號通路可抑制海馬神經系統的發育[12-13]。因此，本研究從ERK和P38信號通路的上游靶蛋白GR探討姜黃素對NSC增殖作用的影響機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

DMEM/F12和B27 supplement，美國Gibco公司；堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)，美國Cali-Bio公司；CytoTox 96非放射性細胞毒性試劑盒，美國Promega公司；姜黃素，二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，噻唑藍〔3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazoliumbromide, MTT〕，多聚鳥氨酸，美國Sigma公司；5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxy uridine，BrdU)細胞增殖檢測試劑盒，美國Merck Millipore公司；大鼠神經上皮干細胞蛋白巢蛋白(nestin)和胚胎干細胞關鍵蛋白(SRY-related HMG-box2, SOX2)抗體，美國Santa公司；大鼠GR抗體，美國Pierce公司；大鼠信號轉導與激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3, Stat3)抗體、磷酸化Stat3(phosphorylated Stat3, p-Stat3)抗體，美國Abcam公司；Trizol，美國Invitrogrn公司；熒光定量PCR儀和SsoFast EvaGreen Supermix，美國Bio-Rad公司；逆轉錄試劑盒，美國Promega公司；Western蛋白印跡法鼠抗兔及抗鼠二抗，碧云天公司；CO2培養箱，酶聯免疫檢測儀，美國Thermo公司；解剖顯微鏡，日本Olympus公司；熒光顯微鏡，日本Nikon公司。0.1%姜黃素DMSO溶液備用。

1.2 細胞制備和鑒定

SD大鼠，體質量250～350 g(溫州醫科大學實驗動物中心，動物許可證編號：SCXK浙20100044)。將雌雄SD大鼠放在定制的鐵籠里進行交配，室溫為21.5～22.5℃，自然照明，12 h晝夜交替飼養，觀察到陰拴日為孕第0天，記為E0。分離E15大鼠的皮質NSC，在含有神經營養因子(2% B27，bFGF 20 μg·L-1和EGF 20 μg·L-1)的DMEM/F12的培養基中進行培養，培養條件為5%CO2, 37℃。培養4～5 d后進行細胞傳代，穩定培養至第2代。24孔板用多聚鳥氨酸鋪板預處理6～12 h，培養的NSC以每孔5×104的細胞密度接種于24孔板上，加入500 μL培養基，培養24 h后，進行NSC標志蛋白巢蛋白及SOX2免疫細胞化學染色鑒定，熒光顯微鏡拍照。

1.3 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)釋放法檢測細胞毒性

96孔板預先用多聚鳥氨酸鋪板12 h。將NSC以每孔2×104的細胞密度接種于加100 μL培養基的96孔板內，在細胞培養箱內孵育培養24 h，細胞隨機分組為正常組、溶劑組、姜黃素0.1，0.5，2.5，12.5和62.5 μmol·L-1組。24 h后按照CytoTox96非放射性細胞毒性試劑盒實驗，檢測并計算細胞死亡率。細胞死亡率(%)=樣品A490 nm/酶活性最大細胞A490 nm×100%。

1.4 MTT法檢測細胞存活

按1.3分組的細胞接板接種于96孔板，每孔加入20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，繼續培養4 h。用酶聯免疫檢測儀檢測A490 nm值,計算細胞活力百分率，細胞存活率(%)=(實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.5 BrdU檢測細胞增殖

96孔板預先用多聚鳥氨酸鋪板12 h，將NSC以每孔2×104的細胞密度接種于加100 μL培養基的96孔板內，按1.3分組的細胞在培養箱內孵育培養24 h，每孔加入20 μL 20%BrdU培養基，放入細胞培養箱孵育24 h。用酶聯免疫檢測儀檢測A490 nm值，計算細胞增殖百分率。細胞增殖百分率(%)=(實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)法檢測神經干細胞增殖相關基因的mRNA水平

以每孔1×106的細胞密度接種，置于細胞培養箱內孵育24 h，按1.3分組的細胞，24 h后，按Trizol試劑說明書提取各組NSC的總RNA，測定總RNA的濃度與A260 nm/A280 nm比值，將RNA逆轉為cDNA用qRT-PCR檢測，采用相對稀釋標準曲線法測定目的基因GR, Stat3, Notch1和p21 mRNA的相對表達水平。其引物序列如下，內參基因RS16：上游引物(F) AAGTCTTCGGACGCAAGAAA；下游引物(R) TTGCCCAGAAGCAGAACAG；目的基因GR: (F) ATACAGCATCCCTTTCTCAGCA；(R) CTTGGCACCTATTCCAGTTTTC；Stat3: (F) TACCAGCAAAATCAGGTTGCT；(R) ACATCCCCAGAGTCCTTATCAA；Notch1：(F) ACATCCCCAGAGTCCTTATCAA；(R) GAAAAGCCACCGAGATAGTCAG；p21：(F):AACTGGGGAGGGCTTTCT；(R) TGTCTTGTCTTCGCTGAGGT。根據雙標準曲線法從各自標準曲線上計算待測樣本初始表達量，將目的基因表達量歸一處理，按照公式基因相對表達量=(待測樣本目的基因初始濃度/待測樣本內參初始濃度)/(對照樣本目的基因初始濃度/對照樣本內參基因初始濃度), 得出樣本目的基因的表達差異。

1.7 Western蛋白印跡法檢測神經干細胞增殖相關基因的蛋白表達

以每孔1×106的細胞密度接種，置于細胞培養箱內孵育24 h，按1.3分組的細胞，24 h后，收集細胞離心沉淀，按照蛋白裂解試劑說明書加入裂解液和磷酸酶抑制劑，置于冰上靜止30 min，EP管內超聲5 s×3次。低溫12 000×g離心10 min，收取上清液。用BCA工作試劑盒測定蛋白濃度，每條泳道蛋白上樣量30 μg，電泳、轉膜后用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入內參蛋白兔抗大鼠β肌動蛋白和目的蛋白GR, Stat3和p-Stat3一抗，按1∶1000的滴度稀釋，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜，加入稀釋比例為1∶5000的鼠抗兔二抗，室溫孵育2 h，TBST充分洗膜，通過曝光后顯示條帶。用Quantity One4.62軟件分析目標蛋白條帶和內參蛋白條帶的積分吸光度(integrated absorbance, IA)，以兩者IA的比值表示目標蛋白的相對表達水平。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 神經干細胞的鑒定

圖1顯示，相差顯微鏡下觀察到培養的原代NSC細胞球(圖A)進行巢蛋白染色鑒定(綠色，圖B)，多聚鳥氨酸鋪板培養的貼壁NSC進行巢蛋白(綠色，圖C)和SOX2(綠色，圖D)免疫熒光染色鑒定，細胞核進行DAPI染色鑒定(藍色)，其中巢蛋白和SOX2綠色染色在DAPI染色的藍色細胞核中陽性率均超過98%，免疫熒光結果證明培養的細胞為NSC。

Fig.1 Photomicrographs of neural stem cells (NSCs) in culture. Cells were separated from embryonic rat brain at day 15 and cultured in proliferation media containing growth factors. A: immunofluorescence image of a neurosphere that was fixed and stained with nestin (green) and then counterstained with nuclear marker DAPI (blue); B: immunofluorescence image of NSCs when grown on 96-well poly-L-O-rnithine coated plates stained with nestin (green, C) or SOX2 (green, D) and then counterstained with nuclear marker DAPI (blue).

2.2 姜黃素對神經干細胞的細胞毒性及存活率影響

表1結果顯示，正常組、溶劑組和姜黃素0.1，0.5及2.5 μmol·L-1組細胞死亡率無統計學差異；與正常對照組和溶劑組相比，姜黃素12.5和62.5 μmol·L-1組細胞死亡率顯著升高(P<0.05)，說明高濃度姜黃素促進NSC中LDH的釋放，對NSC具有細胞毒性。

Tab.1 Cytotoxicity of curcumin on NSCs by lactate dehydrogenase (LDH) release detection

GroupCelldeathrate/%Normalcontrol18．3±1．8DMSO16．2±1．3Curcumin0．117．8±2．6 0．517．7±1．4 2．516．2±1．7 12．530．9±4．4?# 62．547．8±5．1?#

表2結果顯示，與正常對照組和溶劑組相比，姜黃素0.1和12.5 μmol·L-1細胞存活率無顯著差異，姜黃素0.5及2.5 μmol·L-1增強NSC的存活率(P<0.05)；而姜黃素62.5 μmol·L-1則顯著抑制細胞存活(P<0.05)。

Tab.2 Effect of curcumin on cell viability of NSCs by MTT assay

GroupCellviability/%Normalcontrol100．0±0．5DMSO102．1±0．5Curcumin0．1112．4±2．5 0．5131．7±1．4?# 2．5130．3±1．9?# 12．5100．2±0．9 62．559．9±2．2?#

2.3 姜黃素對神經干細胞增殖的影響

如表3所示，與溶劑組相比，姜黃素0.1，0.5和2.5 μmol·L-1組NSC增殖百分率顯著升高(P<0.05)，其中0.5 μmol·L-1組NSC增殖百分率增高最明顯，促增殖作用最強；而姜黃素12.5和62.5 μmol·L-1組NSC明顯降低(P<0.05)，說明高濃度抑制NSC增殖。

Tab.3 Effect of curcumin on NSCs proliferation by BrdU assay

GroupBrdUpositiverate/%Normalcontrol100．0±1．6DMSO99．5±2．6Curcumin0．1103．9±1．2?# 0．5121．3±2．4?# 2．5104．6±1．6?# 12．558．9±2．2?# 62．59．7±0．7?#

2.4 姜黃素對神經干細胞增殖相關基因表達的影響

熒光定量PCR(表4)顯示，與溶劑組相比，經姜黃素0.5 μmol·L-1處理后的NSC GR基因的表達顯著下降(P<0.05)，但對Stat3, Notch1和p21 mRNA無影響。

Tab.4 Effect of curcumin on mRNA expression of GR, SOX2, Notch1 and p21 by qRT-PCR

GroupmRNAexpressionGR Stat3Notch1p21Normalcontrol51±874±3050±3050±17DMSO49±2167±3437±2032±25Curcumin0．526±10?#40±3634±2437±34

2.5 姜黃素對神經干細胞增殖相關蛋白表達的影響Western蛋白印跡結果顯示(表5和圖2)，與溶劑組相比，姜黃素0.5 μmol·L-1處理后，GR, Stat3和p-Stat3蛋白的相對表達顯著降低(P<0.05)。

Tab.5 Effect of curcumin on GR, Stat3 and p-Stat3 protein expression

GroupProteinexpression(IATargetprotein∶IAβ?Actin)GRStat3p?Stat3Normalcontrol1．29±0．281．12±0．041．13±0．08DMSO1．10±0．201．02±0．041．08±0．10Curcumin0．50．58±0．23?#0．80±0．05?#0．78±0．17?#

Fig.2 Effect of curcumin on GR(A)and Stat3 and p-Stat3 protein expression(B) by Western blotting. Lane 1: control; lane 2: DMSO; lane 3: curcumin 0.5 μmol·L-1for 24 h.

3 討論

本研究結果發現，姜黃素低濃度組促進NSC增殖，其中以姜黃素0.5 μmol·L-1組對NSC的增殖促進作用最強；而姜黃素高濃度組抑制NSC的增殖。qRT-PCR及Western蛋白印跡結果顯示，姜黃素0.5 μmol·L-1處理組中NSC GR的mRNA表達明顯降低，GR蛋白的表達水平也明顯降低；Stat3 mRNA的表達有一定的下降趨勢但沒有統計學意義上的改變，Stat3總蛋白及p-Stat3蛋白的表達水平卻發生降低。說明姜黃素抑制了GR的轉錄過程和蛋白翻譯過程，同時可能也抑制了Stat3的轉錄過程但其抑制作用不明顯，通過蛋白的級聯放大作用后，總蛋白水平發生降低。研究表明，GR是類固醇/甲狀腺激素受體超家族的一個受體依賴性的轉錄因子，可通過經典信號通路與核內糖皮質激素反應元件(glucocorticoids response element，CRE)結合，然后導致含有GR結合元件的靶基因激活或抑制[14]。然而，GR也可以通過非經典信號通路(直接蛋白-蛋白間的相互作用)與其他相關信號通路相互作用發生反應。研究表明，GR的DNA結合元件和Stat3結合元件具有相同的DNA序列，兩者結合至相應的DNA結合元件后，GR和Stat3可通過直接蛋白-蛋白的相互作用調控彼此的下游靶基因表達[15]。另有研究表明，快速GR通路可激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路[16]，MAPK信號通路主要包括ERK、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)和P38。其中ERK途徑參與細胞因子、生長因子、激素和絲裂原受體活化信號的轉導，細胞的增殖主要與這條通路有關。在Kuroki等[17]實驗中，姜黃素激活了細胞外的ERK和P38激酶；而另有研究表明，ERK信號通路的激活可以作用于Stat3上的共激活位點Ser-727抑制其磷酸化。STAT是近年來研究發現的一條由細胞因子刺激的信號轉導通路，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調節等許多重要的生物學過程。研究表明，Stat3促進小鼠胚胎干細胞中神經元的分化[18]，維持NSC的自我更新[19]。因此可推斷GR可能在該作用機制中起到主導作用，作為ERK信號通路的上游分子調節ERK信號通路的下游分子Stat3的表達。通過與其他信號通路或直接蛋白-蛋白接觸的相互作用，參與姜黃素對NSC的增殖促進作用。Notch1能維持NSC或神經前體細胞的更新分裂能力，提高NSC的增殖存活能力，維持NSC穩定。p21是一種能夠調節細胞周期的基因，屬于細胞周期蛋白激酶抑制劑家族一員。當處于應激狀態，正常發育過程以及分化時，能夠被誘導產生。但在本研究中，二者的表達水平未發生改變，因此認為姜黃素對大鼠NSC的增殖促進作用可能與這兩個基因無關。綜上所述，姜黃素對NSC的增殖作用可能與GR信號通路有關，其具體機制可能是姜黃素抑制GR mRNA 和蛋白水平的表達，進而通過ERK通路調節Stat3蛋白表達或GR與Stat3之間直接相互作用，最后調控細胞的增殖。本研究結果顯示，GR參與了NSC增殖的調控，但其中具體調控機制仍需GR基因沉默的技術進一步來證明。由于本研究是在離體實驗中進行的，需要進一步的動物實驗證明。

[1] Lim GP, Chu T, Yang F, Beech W, Frautschy SA, Cole GM. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse[J].JNeurosci, 2001, 21(21):8370-8377.

[2] Nam SM, Choi JH, Yoo DY, Kim W, Jung HY, Kim JW,etal. Effects of curcumin (Curcumalonga) on learning and spatial memory as well as cell proliferation and neuroblast differentiation in adult and aged mice by upregulating brain-derived neurotrophic factor and CREB signaling[J].JMedFood, 2014, 17(6):641-649.

[3] Rajasekar N, Dwivedi S, Tota SK, Kamat PK, Hanif K, Nath C,etal. Neuroprotective effect of curcumin on okadaic acid induced memory impairment in mice[J].EurJPharmacol, 2013, 715(1-3):381-394.

[4] Tiwari V, Chopra K. Protective effect of curcumin against chronic alcohol-induced cognitive deficits and neuroinflammation in the adult rat brain[J].Neuroscience, 2013, 244:147-158.

[5] Huang Z, Zhong XM, Li ZY, Feng CR, Pan AJ, Mao QQ. Curcumin reverses corticosterone-induced depressive-like behavior and decrease in brain BDNF levels in rats[J].NeurosciLett, 2011, 493(3):145-148.

[6] Tiwari SK, Agarwal S, Seth B, Yadav A, Nair S, Bhatnagar P,etal. Curcumin-loaded nanoparticles potently induce adult neurogenesis and reverse cognitive deficits in Alzheimer′s disease model via canonical Wnt/β-catenin pathway[J].ACSNano, 2014, 8(1):76-103.

[7] Doggui S, Sahni JK, Arseneault M, Dao L, Ramassamy C. Neuronal uptake and neuroprotective effect of curcumin-loaded PLGA nanoparticles on the human SK-N-SH cell line[J].JAlzheimersDis, 2012, 30(2):377-392.

[8] Zhu YG, Chen XC, Chen ZZ, Zeng YQ, Shi GB, Su YH,etal. Curcumin protects mitochondria from oxidative damage and attenuates apoptosis in cortical neurons[J].ActaPharmacolSin, 2004, 25(12):1606-1612.

[9] Xu Y, Li S, Vernon MM, Pan J, Chen L, Barish PA,etal. Curcumin prevents corticosterone-induced neurotoxicity and abnormalities of neuroplasticity via 5-HT receptor pathway[J].JNeurochem, 2011, 118(5):784-795.

[10] Kim SJ, Son TG, Park HR, Park M, Kim MS, Kim HS,etal. Curcumin stimulates proliferation of embryonic neural progenitor cells and neurogenesis in the adult hippocampus[J].JBiolChem, 2008, 283(21):14497-14505.

[11] Bose R, Moors M, Tofighi R, Cascante A, Hermanson O, Ceccatelli S. Glucocorticoids induce long-lasting effects in neural stem cells resulting in senescence-related alterations[J].CellDeathDis, 2010, 1:e92.

[12] David DJ, Samuels BA, Rainer Q, Wang JW, Marsteller D, Mendez I,etal. Neurogenesis-dependent and -independent effects of fluoxetine in an animal model of anxiety/depression[J].Neuron, 2009, 62(4):479-493.

[13] Fujioka A, Fujioka T, Ishida Y, Maekawa T, Nakamura S. Differential effects of prenatal stress on the morphological maturation of hippocampal neurons[J].Neuroscience, 2006, 141(2):907-915.

[14] Cato AC, Nestl A, Mink S. Rapid actions of steroid receptors in cellular signaling pathways[J].SciSTKE, 2002, 2002(138):re9.

[15] Langlais D, Couture C, Balsalobre A, Drouin J. The Stat3/GR interaction code: predictive value of direct/indirect DNA recruitment for transcription outcome[J].MolCell, 2012, 47(1):38-49.

[16] Samarasinghe RA, Witchell SF, DeFranco DB. Cooperativity and complementarity: synergies in non-classical and classical glucocorticoid signaling[J].CellCycle, 2012, 11(15):2819-2827.

[17] Kuroki M, O′Flaherty JT. Extracellular signal-regulated protein kinase (ERK)-dependent and ERK-independent pathways target STAT3 on serine-727 in human neutrophils stimulated by chemotactic factors and cytokines[J].BiochemJ, 1999, 341(Pt 3):691-696.

[18] Wei ZZ, Yu SP, Lee JH, Chen D, Taylor TM, Deveau TC,etal. Regulatory role of the JNK-STAT1/3 signaling in neuronal differentiation of cultured mouse embryonic stem cells[J].CellMolNeurobiol, 2014, 34(6):881-893.

[19] Matsuda T, Nakamura T, Nakao K, Arai T, Katsuki M, Heike T,etal. STAT3 activation is sufficient to maintain an undifferentiated state of mouse embryonic stem cells[J].EMBOJ, 1999, 18(15):4261-4269.

(本文編輯: 喬 虹)

Curcumin stimulates proliferation of rat neural stem cellsby inhibiting glucocorticoid receptors

MA Xiao-xiao, WANG Chun-man, ZHANG Gao-long, ZUO Chun-long, HUANG Yi-xiang,LIU Jin, LIAN Qing-quan, LIN Han

(DepartmentofAnesthesiology,theSecondAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China)

OBJECTIVE To investigate the effect of curcumin on proliferation of neural stem cells (NSCs) of rats and the mechanism. METHODS NSCs derived from the forebrain of rat E15 embryos were culturedinvitroand identified by neuroepithelial stem cell protein (nestin and SOX2) staining. NSCs were treated with curcumin 0.1, 0.5, 2.5, 12.5 and 62.5 μmol·L-1for 24 h, respectively. The cytotoxicity was estimated by measuring the release of lactate dehydrogenase(LDH). Cell viability and proliferation were analyzed respectively by MTT and BrdU assay. The mRNA expression levels of glucocorticoid receptor (GR), Stat3, Notch1 and p21 were detected by qRT-PCR. The protein expression levels of total GR, Stat3 and phosphorylated Stat3 were measured by Western blotting. RESULTS The primary neural stem cells were identified as NSCs. Curcumin 12.5 and 62.5 μmol·L-1had cell cytotoxicity(P<0.05). Cell viability assay indicated that curcumin 0.5 and 2.5 μmol·L-1enhanced NSCs viability(P<0.05), but in 62.5 μmol·L-1group the cell cytotoxicity was inhibited(P<0.05). Curcumin 0.1, 0.5 and 2.5 μmol·L-1increased NSCs proliferation(P<0.05), whereas 12.5 and 62.5 μmol·L-1caused a decrease in NSCs proliferation(P<0.05). The mRNA expression level of GR in 0.5 μmol·L-1group was significantly reduced(P<0.05). Western blotting analysis revealed that the protein expression of GR, Stat3 and p-Stat3 was inhibited by curcumin in 0.5 μmol ·L-1group(P<0.05). CONCLUSION Curcumin stimulates NSCs proliferation, possibly by inhibiting GR mRNA and related protein expression.Key words: curcumin; neural stem cells; cell proliferation; receptors, glucocorticoid

LIN Han, E-mail: nanlinhannansh@qq.com; LIAN Qing-quan, E-mail: lianqingquanmz@163.com

浙江省科技廳錢江人才計劃(2012R10073)；浙江省自然科學基金(Y14H090071)；浙江省醫藥衛生平臺重點資助計劃(2012ZDA037)；浙江省衛生廳中醫藥優秀青年人才基金計劃(2010ZQ011)

馬曉曉，女，碩士研究生，主要從事神經毒理學研究；林 函，男，博士，主要從事麻醉藥神經發育毒性的研究；連慶泉，男，博士，主要從事麻醉藥成癮性研究。

林 函, E-mail: nanlinhannansh@qq.com; 連慶泉, E-mail: lianqingquanmz@163.com

R962,R285.5

A

1000-3002(2015)02-0202-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.003

Foundation item: The project supported by Qianjiang Talents Program of Zhejiang Provincial Science and Technology Bureau(2012R10073); Zhejiang Provincial Natural Science Foundation(Y14H090071); Zhejiang Provincial Medical and Health Platform(2012ZDA037); and Youth Talents Funding Program of Zhejiang Provincial Health Bureau of Traditional Chinese Medicine(2010ZQ011)

2014-12-02 接受日期: 2015-03-05)

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