苦參堿體外對人髓母細胞瘤D341細胞增殖、凋亡和自噬的作用

周開宇, 吉海龍, 毛天明, 白志強

(1. 臺州學院醫學院附屬臺州市立醫院神經外科, 復旦大學附屬華山醫院臺州分院, 浙江 臺州 318000;2. 溫州醫科大學附屬第一臨床學院, 浙江 溫州 325000)

苦參堿體外對人髓母細胞瘤D341細胞增殖、凋亡和自噬的作用

周開宇1,2, 吉海龍2, 毛天明1, 白志強1

(1. 臺州學院醫學院附屬臺州市立醫院神經外科, 復旦大學附屬華山醫院臺州分院, 浙江 臺州 318000;2. 溫州醫科大學附屬第一臨床學院, 浙江 溫州 325000)

目的 探討苦參堿在體外誘導人髓母細胞瘤D341細胞增殖、凋亡和自噬的作用。方法 體外培養細胞，隨機分為對照組、苦參堿0.5, 1.0, 1.5和2.0 g·L-1組，作用時間為24，48和72 h。CCK-8法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡，透射電鏡觀察細胞結構，Western蛋白質印跡法檢測細胞Bax、Bcl-2、胱天蛋白酶3及自噬相關蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)和Bcl-2同源結構域蛋白抗體beclin1蛋白表達。隨后在苦參堿作用前1 h加入終濃度為5 mmol·L-1的自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)，觀察細胞beclin1和LC3蛋白表達的變化。結果 苦參堿0.5～2.0 g·L-1能明顯抑制D341細胞增殖，具有濃度效應關系(r24 h=0.994，r48 h=0.992，r72 h=0.996，P<0.01)，而且可誘導D341細胞凋亡(r24 h=0.937，r48 h=0.947，r72 h=0.987，P<0.01)；苦參堿濃度為2.0 g·L-1時，對D341細胞增殖的抑制作用(r=0.999，P<0.01)和凋亡的誘導作用(r=0.990，P<0.01)具有時間效應關系。透射電鏡觀察發現，苦參堿2.0 g·L-1作用24 h，D341細胞出現氣穴樣的空泡結構，細胞染色質濃縮、邊緣化；作用48 h，細胞核染色質濃縮明顯，細胞胞漿中可見空泡；作用72 h，細胞核固縮明顯，部分細胞可見核裂解，空泡明顯增大。Western蛋白質印跡法實驗結果表明，苦參堿0.5～2.0 g·L-1增強D341細胞Bax蛋白表達(r24 h=0.981，r48 h=0.967，r72 h=0.998，P<0.01)，抑制Bcl-2蛋白表達(r24 h=-0.977，r48 h=-0.989，r72 h=-0.968，P<0.01)。苦參堿作用48 h可增強D341細胞胱天蛋白酶3的表達(r48 h=0.995，P<0.01)，作用24, 48和72 h能增強D341細胞beclin1蛋白的表達，具有濃度效應關系(r24 h=0.989，r48 h= 0.986，r72 h=0.966，P<0.01)，自噬抑制劑3-MA可抑制此作用(P<0.05)。苦參堿能使D341細胞LC3-Ⅰ蛋白表達減少，LC3-Ⅱ表達增加， LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低(r24 h=-0.795，r48 h=-0.886，r72 h=-0.901，P<0.05)；自噬抑制劑3-MA可抑制苦參堿對LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白表達的影響 (P<0.05)。 結論 苦參堿體外具有抑制D341細胞增殖、誘導凋亡和促進自噬的作用。

苦參堿; 細胞增殖; 細胞凋亡; 自噬

苦參堿(matrine)是豆科槐屬植物中生物堿的主要成分，屬于四環的喹嗪啶類，具有利尿解毒、退黃降酶和清熱利濕等藥理活性，且無明顯的毒性作用[1-2]。近年來研究發現，苦參堿能明顯地誘導胃癌細胞凋亡，抑制細胞增殖[3]。髓母細胞瘤是來源于原始神經胚胎殘余上皮細胞，好發于兒童，惡性程度極高，術后較易復發，對常規的放、化療不敏感，預后差，嚴重威脅到兒童的健康[4]。苦參堿對人髓母細胞瘤細胞增殖和凋亡的作用尚少有報道。本研究觀察苦參堿對人髓母細胞瘤D341細胞增殖、凋亡和自噬的影響，并觀察凋亡相關蛋白和自噬相關蛋白表達的變化，為探索苦參堿對人髓母細胞瘤的作用機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器D341細胞由北京協和醫院細胞庫提供。苦參堿由寧波天衡制藥有限公司提供，純度為98%。RPMI 1640培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司；AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒由上海藍基生物科技有限公司提供；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所；鼠抗人Bax抗體和Bcl-2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3)-Ⅰ和Ⅱ和beclin1兔多克隆抗體、辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG抗體購自美國Santa Cruz公司；化學發光試劑盒和Western蛋白質印跡試劑盒購自北京Qiangen公司；DBA顯色試劑盒購自中杉金橋公司；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)購自北京樂博生物科技有限公司；其他試劑均由上海藍基生物科技有限公司提供。細胞培養板，美國Corning公司；透射電子顯微鏡，日本JEM-1011公司；酶標儀型號：美國BioTekEL-x800；超速離心機，德國Sorvall, D-37520公司；流式細胞儀，美國FACS Calibur Becton-Dickinson公司；Western電泳儀，美國Bio-Rad 164-5051公司；分光光度計，日本 SHIMAZDU UV-2540公司。

1.2 細胞培養將D341細胞置于10%胎牛血清培養液和含1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640中，并于37℃，5%CO2和飽和濕度的恒溫培養箱中培養。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖將培養的D341細胞調整為5×107 L-1細胞懸液，取96孔細胞培養板，每孔加入100 μL細胞懸液，再培養24 h；每孔加入200 μL含苦參堿培養基，苦參堿終濃度分別為0.5，1.0，1.5和2.0 g·L-1，同時設立細胞對照組；分別培養24, 48和72 h后每孔加入10 μL CCK-8，培養3 h，混勻10 min，以酶標儀測定各孔的吸光度值(A450 nm)。每濃度設3復孔，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%) =(細胞對照組A450 nm-給藥組A450 nm) /細胞對照組A450 nm×100%。

1.5 透射電鏡觀察細胞超微結構體外培養的D341細胞隨機分為對照組和苦參堿2.0 g·L-1組，培養24, 48和72 h后，8000×g離心5 min，收集細胞，洗滌，固定，再脫水，包埋，常規超薄切片，透射電鏡下觀察細胞超微結構。

1.6 Western蛋白質印跡法檢測細胞Bax、Bcl-2、胱天蛋白酶3、beclin1和LC3蛋白表達D341瘤細胞接種于24孔板中，每孔200 μL，細胞密度為5×107 L-1，待細胞貼壁生長后再分組?？鄥A組加入苦參堿0.5, 1.0, 1.5和2.0 g·L-1；3-MA預處理組在加苦參堿作用前1 h加入3-MA，3-MA終濃度為5 mmol·L-1；同時設3-MA對照組，只加3-MA，終濃度5 mmol·L-1；對照組只加細胞培養液。各組分別培養24, 48和72 h，收集細胞。加入100 μL細胞裂解液混勻后，放冰上孵育30 min，12 000×g，4℃離心15 min，留上清液，以BCA法測定蛋白質濃度。常規制膠、上樣、電泳、轉膜、封閉。分別加一抗即抗Bax (1∶5000)、Bcl-2(1∶1000)、胱天蛋白酶3 (1∶1000)、LC3-Ⅰ(1∶200)、LC3-Ⅱ(1∶150)、beclin1和β肌動蛋白(鼠抗1∶1000)抗體，4℃孵育過夜。TBST洗膜，將膜與二抗辣根過氧化酶標記羊抗兔IgG抗體(1∶5000) 室溫下搖蕩孵育2 h，再TBST充分洗膜。顯色、曝光、顯影、定影，掃描各條帶積分吸光度(integrated absorbance, IA)，以β肌動蛋白作內參照，待測蛋白的相對表達水平用IA目標蛋白/IAβ肌動蛋白表示。

2 結果

2.1 苦參堿對D341細胞增殖的抑制作用圖1結果顯示，苦參堿作用24, 48和72 h，苦參堿對D341細胞增殖的抑制作用呈濃度依賴性(r24 h=0.994，r48 h=0.992，r72 h=0.996，P<0.01)。苦參堿濃度為2.0 g·L-1時，對D341細胞增殖的抑制作用具有時間依賴性(r=0.999，P<0.01)。

2.2 苦參堿對D341細胞凋亡的誘導作用圖2和圖3結果顯示，苦參堿能明顯誘導D341細胞凋亡，細胞凋亡率與苦參堿濃度呈正相關(r24 h=0.937，r48 h=0.947，r72 h=0.987，P<0.01)；在苦參堿濃度為2.0 g·L-1時，誘導D341細胞凋亡的作用隨作用時間延長而增加(r=0.99，P<0.01)。

Fig.2 Effect of matrine for 72 h on D341 cell apoptosis by flow cytometry. A, B, C, D and E: matrine 0, 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 g·L-1group, respectively.

2.3 苦參堿對D341細胞超微結構的影響透射電鏡觀察D341細胞超微結構(圖4)發現，對照組細胞膜完整，染色質分布均勻(圖4A)?？鄥A作用 24 h，細胞體積變小，出現氣穴樣的空泡結構，細胞染色質濃縮、邊緣化(圖4B)。作用48 h，細胞核染色質濃縮明顯，部分呈新月狀附在核膜周圍，細胞胞漿中可見空泡(圖4C)。作用 72 h后，細胞核固縮明顯，部分細胞可見核裂解，空泡明顯增大(圖4D)。

Fig.4 Effect of matrine 2.0 g·L-1on D341 cell ultrastructure observation with transmission electron microscope (×50 000). A: normal control; B: 24 h, the arrow shows the early apoptotic cells with acoustic cavitation bubble structure, chromatin condensation, and marginalization; C: 48 h, the arrow shows nuclear chromatin condensation, more vacuoles in the cytoplasm; D: 72 h, the arrow shows the significantly increased and larger cytoplasmic vacuoles.

2.4 苦參堿對D341細胞Bax、Bcl-2和胱天蛋白酶3蛋白表達水平的變化由圖5可以看出，隨著苦參堿濃度的增加，D341細胞Bax的表達逐漸增強(r24 h=0.981，r48 h=0.967，r72 h=0.998，P<0.01)，Bcl-2的表達逐漸下降(r24 h=-0.977，r48 h=-0.989，r72 h=-0.968，P<0.01)。由圖6所示，苦參堿與D341細胞作用48 h，隨著苦參堿濃度的增加，D341細胞胱天蛋白酶3的表達逐漸增強(r48 h=0.995，P<0.01)。

2018年10月，在廣東省航道事務中心的領導和部署下，韶關、北江航道事務中心開始為北江船閘統一運營管理做好準備工作。廣東省航道事務中心聯合北江、韶關航道事務中心赴廣西西江長洲樞紐開展北江船閘統一管理調研工作。2018年11月，廣東省省航道事務中心在廣州市召開北江船閘統一運營管理工作專題會議，研究部署北江船閘統一運營管理有關工作。

2.5 苦參堿對D341細胞beclin1蛋白表達的影響如圖7所示，苦參堿與D341細胞作用24, 48和72 h，隨著苦參堿濃度的增加，D341細胞beclin1蛋白的表達增加(r24 h=0.989，r48 h=0.986，r72 h=0.966，

P<0.01)。在苦參堿作用之前加入自噬抑制劑3-MA，可抑制苦參堿導致的beclin1蛋白表達的增加(P<0.05)。

Fig.8 Effect of matrine for 24(A), 48(B) and 72 h(C) on microtubule associated protein 1 light chain-Ⅰ(LC3-Ⅰ) and LC3-Ⅱexpression of D341 cells observed by Western blotting. Lane 1, 2, 3, 4 and 5: matrine 0, 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 g·L-1, respectively; lane 6, 7, 8, 9 and 10: 3-MA+matrine 0, 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 g·L-1, respectively; A2, B2 and C2: the semi-quantitative results of A1, B1 and C1, respectively.

3 討論

苦參堿具有抗腫瘤作用。Zhang等[5]對前列腺癌進行研究，發現苦參堿能明顯抑制前列腺癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，增強胱天蛋白酶3和Bax蛋白的表達，降低Bcl-2蛋白的表達。本研究用人髓母細胞瘤D341細胞研究發現，苦參堿對D341細胞增殖亦具有抑制作用，能明顯誘導D341細胞凋亡，Bax和胱天蛋白酶3蛋白表達增強，Bcl-2表達降低，與上述研究結果一致。Bcl-2蛋白家族在誘導凋亡的線粒體信號轉導途徑中起著重要的作用，在腫瘤細胞中高表達[6]。細胞在凋亡過程中主要表現為Bcl-2蛋白表達減少，Bax蛋白表達增加，Bcl-2抑制細胞凋亡的機制可能是拮抗凋亡促進基因Bax表達[7]。因此提示，苦參堿可能是通過激活胱天蛋白酶3的表達、調控Bcl-2和Bax的表達而誘導D341細胞凋亡，抑制D341細胞增殖。另外，本研究還觀察了苦參堿對D341細胞自噬的影響。細胞自噬與細胞凋亡和細胞衰老一樣，是十分重要的生物學現象，參與生物的發育和生長等多種過程，細胞自噬的異常導致癌細胞的出現。Beclin1是自噬通路上第1個被確認的腫瘤抑制因子，在多種惡性腫瘤中均存在著表達減少的現象，其雜合子的缺失也被認為是細胞發生惡性轉化的原因之一[8-10]。LC3是哺乳動物細胞中酵母自噬相關基因agt的同源物[11-12]，參與自噬體的形成，有Ⅰ型和Ⅱ型。未發生自噬時，細胞內合成的 LC3 經過加工，成為胞漿可溶性的LC3-Ⅰ型。當自噬發生時，LC3-Ⅰ型經泛素樣加工修飾，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺結合，形成LC3-Ⅱ型。LC3-Ⅱ含量與自噬泡數量成正比。因此，LC3的表達強度與自噬活性密切相關[13]。Deng等[14]曾對腎透明細胞癌進行研究，發現癌細胞已發生轉移者，自噬活性明顯低于病灶尚呈局灶者；LC3-Ⅱ表達越低，其預后越差。Yu等[15]認為，beclin1蛋白表達可作為胃癌獨立的預后監測因素，beclin1表達陰性的胃癌患者，往往有遠處轉移，預后很差。本研究結果表明，苦參堿能使D341細胞beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表達增加，LC3-Ⅰ蛋白表達減少，LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低，且具有濃度效應關系。自噬抑制劑3-MA可逆轉苦參堿對上述蛋白表達的影響。由此表明，苦參堿在抑制D341細胞增殖、誘導D341細胞凋亡的同時，還可以誘導D341細胞自噬。苦參堿誘導D341細胞自噬的作用機制尚待深入研究。本研究為將苦參堿用于治療人髓母細胞瘤提供了參考。

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(本文編輯: 齊春會)

Effect of matrine on cell proliferation, apoptosis and autophagyof human medulloblastoma D341 cells in vitro

ZHOU Kai-yu1,2, JI Hai-long2, MAO Tian-ming1, BAI Zhi-qiang1

(1.DepartmentofNeurosurgery,TaizhouMunicipalHospitalAffiliatedtoTaizhouMedicalCollege,TaizhouBranchHospitalofHuashanHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Taizhou318000,China; 2.TheFirstClinicalCollegeAffiliatedtoWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China)

OBJECTIVE To explore the effect of matrine induced proliferation, apoptosis and autophagy on human medulloblastoma cell line D341invitro. METHODS D341 cellsinvitrowere incubated with matrine 0, 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 g·L-1for 24, 48 and 72 h, respectively. The proliferation of D341 cells was analyzed using Cell Counting Kit-8 assay. Apoptosis was detected by flow cytometry. The morphologic change of cells was observed under a transmission electron microscope. The expression of Bax, Bcl-2, caspase 3, microtubule associated protein 1 light chain 3 (LC3) and beclin1 was detected by Western blotting, and the expression of LC3 and beclin1 was detected by Western blotting with or without the autophagy inhibitor 3-methyladenine(3-MA). 3-MA was added 1 h before matrine and the final concentration of 3-MA was 5 mmol·L-1. RESULTS Matrine significantly inhibited the proliferation of D341 cells. There was a concentration-effect relationship (r24 h=0.994,r48 h=0.992,r72 h=0.996,P<0.01). Matrine could induce the cell apoptosis (r24 h=0.937,r48 h=0.947,r72 h=0.987,P<0.01). When the concentration of matrine was 2.0 g·L-1, the inhibitory effect on D341 cell proliferation (r=0.999,P<0.01) and the induction of cell apoptosis (r=0.990,P<0.01) had a time-dependence. When the concentration of matrine was 2.0 g·L-1, the ultrastructure of the D341 cells had obvious change. Cells with acoustic cavitation bubble structure, chromatin condensation, and marginalization were observed after matrine treatment for 24 h. After 48 h treatment with matrine, nuclear chromatin condensation and more vacuoles in the cytoplasm were observed. After 72 h treatment with matrine, cells exhibited apoptotic characteristics with obvious nuclear chromatin condensation, and nuclear fragmentation, significantly increased the larger cytoplasmic vacuoles. Western blotting analysis showed that matrine could increase the expression of Bax (r24 h=0.981,r48 h=0.967,r72 h=0.998,P<0.01), and decrease the expression of Bcl-2 (r24 h=-0.977,r48 h=-0.989,r72 h=-0.968,P<0.01). Matrine could increase the expression of caspase 3 when the effect time was 48 h (r48 h=0.995,P<0.01). Matrine also increased the expression of beclin1 (r24 h=0.989,r48 h=0.986,r72 h=0.966,P<0.01). The autophagy inhibitor 3-MA could reduce this effect (P<0.05). Matrine decreased the expression of LC3-Ⅰ but increased the expression of LC3-Ⅱ and thus the ratio of LC3-Ⅰ/LC-Ⅱ was decreased (r24 h=-0.795,r48 h=-0.886,r72 h=-0.901，P<0.05). 3-MA could reduce the effects of matrine on LC3-Ⅰ and LC3-Ⅱ expression of D341 cells (P<0.05). CONCLUSION Matrine can inhibit proliferation, induce apoptosis and promote autophagy of D341 cellsinvitro.

matrine; cell proliferation; apoptosis; autophagy

ZHOU Kai-yu, E-mail: kerry2000year@163.com

浙江省中醫藥管理局科技計劃資助項目(2013ZA133)

周開宇(1972-)，男，醫學碩士，主任醫師，碩士生導師，主要從事神經外科腫瘤的臨床及基礎研究。

周開宇, E-mail: kerry2000year@163.com, Tel: 13957680507

Foundation item: The project supported by Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan of Zhejiang Province (2013ZA133)

2014-07-21 接受日期: 2015-02-20)

R979.1

A

1000-3002(2015)02-0240-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.009

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