丙戊酸對乳腺癌細胞放射敏感性的影響

趙錫鵬, 羅 月, 董 超, 張鳳梅, 鳳志慧

(山東大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境與健康系, 山東 濟南 250012)

丙戊酸對乳腺癌細胞放射敏感性的影響

趙錫鵬, 羅 月, 董 超, 張鳳梅, 鳳志慧

(山東大學公共衛(wèi)生學院環(huán)境與健康系, 山東 濟南 250012)

目的 探討丙戊酸(VPA)對乳腺癌細胞MCF7放射敏感性的影響。方法 MCF7細胞用VPA臨床安全劑量0.5 mmol·L-1和臨界劑量1 mmol·L-1分別預處理0, 24, 48和72 h，8Gy電離輻射后6 h，免疫熒光染色法觀察磷酸化組蛋白H2AX(γ-H2AX)焦點形成。對數(shù)生長期的MCF7細胞分別以VPA 0.5和1 mmol·L-1預處理72 h，4 Gy電離輻射后48 h，MTT法檢測細胞存活率。MCF7細胞用VPA 0.5 mmol·L-1預處理24 h后，按照每皿接種細胞數(shù)分別給予電離輻射2 Gy(每皿500和1000)，4 Gy(每皿2000和4000)和6 Gy(每皿8000和16000)，計算克隆形成率。MCF7細胞分別用VPA 0.5和1 mmol·L-1預處理0, 24, 48和72 h，流式細胞儀檢測細胞周期。結果 與正常對照組相比，單獨VPA 0.5 mmol·L-1處理0, 24, 48和72 h后，γ-H2AX焦點陽性率分別為(5.3±0.6)%，(10.8±1.0)%，(12.6±0.9)%和(17.8±1.1)%(r=0.985,P<0.05)；VPA 1 mmol·L-1對γ-H2AX焦點形成有相同的影響趨勢。單獨照射組細胞核內γ-H2AX焦點陽性率為100%，其中表示DNA損傷較重的焦點較大且明亮的B類細胞所占比例為(16.5±1.8)%；與單獨照射組相比，VPA 0.5 mmol·L-1預處理0, 24, 48和72 h后，B類細胞所占比例分別為(16.5±1.8)%，(28.9±1.0)%，(58.0±2.0)%和(70.8±0.9)%(r=0.986,P<0.05)；VPA 1 mmol·L-1對輻射誘導的γ-H2AX焦點形成的影響有相同趨勢。MTT和細胞克隆形成實驗結果顯示，與正常對照組相比，單獨給予VPA 0.5 mmol·L-1可顯著降低細胞克隆形成率(P<0.05)；與單獨照射組相比，VPA預處理后接受電離輻射能顯著降低細胞存活率(P<0.05)和細胞克隆形成率(P<0.05)；VPA 0.5和1 mmol·L-1對細胞周期影響均無統(tǒng)計學差異。結論 臨床安全劑量和臨界劑量VPA對腫瘤細胞具有放射增敏作用，且對腫瘤細胞生長具有抑制作用，其機制與增加電離輻射所致的DNA雙鏈斷裂損傷的蓄積有關。

丙戊酸; 乳腺癌; DNA損傷; 放射增敏; 細胞周期

丙戊酸(valproic acid, VPA)在臨床上被廣泛應用于治療癲癇病和其他痙攣性疾病，是具代表性的組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)抑制劑之一[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，VPA、伏立諾他、曲古抑菌素A和苯異羥肟酸-24781等新型HDAC抑制劑均可以造成DNA雙鏈斷裂增加[2]，例如苯異羥肟酸-24781能顯著增加HCT116, NCI-H460和A549細胞對電離輻射(ionizing radiation, IR)的敏感性，使其細胞克隆形成率明顯下降[3]；伏立諾他可抑制人卵巢癌紫杉醇耐藥細胞OC3/P的存活，對肝癌細胞具有殺傷作用[4-5]。已有研究報道，VPA 1 mmol·L-1可增強乳腺癌細胞對IR的敏感性[6]，但VPA治療癲癇病的正常血藥濃度為50～120 mg·L-1(相當于0.3～0.8 mmol·L-1)。VPA在治療癲癇病的安全血藥劑量或臨界劑量內對乳腺癌細胞放射敏感性的影響尚未見報道。故本研究選擇VPA在癲癇治療的臨床安全劑量0.5 mmol·L-1和臨界劑量1 mmol·L-1，探討其對乳腺癌細胞放射敏感性的影響，為應用于腫瘤放射治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑MCF7細胞購自美國ATCC公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；高糖DMEM購自上海立菲生物技術有限公司；胰蛋白酶購自北京索萊寶生物科技有限公司；VPA，MTT 和DAPI均購自美國Sigma公司；抗磷酸化的組蛋白H2AX(γ-H2AX)抗體購自美國Millipore公司；熒光標記羊抗鼠二抗購自美國Invitrogen公司。

1.2 儀器設備CO2細胞培養(yǎng)箱，北京博奧恒信生物科技有限公司；超凈工作臺，濟南杰康凈化設備廠；8孔細胞培養(yǎng)板，美國BD公司；普通光學倒置顯微鏡、熒光顯微鏡，日本Olympus公司；Primus S型醫(yī)用直線加速器，德國西門子公司；電泳儀，美國Bio-Rad公司；高速離心機，美國Thermo公司；M200PRO酶標儀，瑞士Tecan公司。

1.3 細胞培養(yǎng)MCF7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至80%～90%融合度時，用0.25%含EDTA胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.4 電離輻射將受試細胞置于醫(yī)用直線加速器上接受IR處理。細胞照射的條件：6 MV X射線，吸收劑量率2.33 Gy·min-1；射野為40 cm×40 cm。根據(jù)吸收劑量率，計算IR劑量2，4，6和8 Gy照射細胞所需的時間分別為0.86，1.72，2.58和3.43 min。

1.5 免疫熒光染色實驗觀察焦點形成MCF7細胞消化后接種于4塊8孔細胞培養(yǎng)板中，用VPA 0.5和1 mmol·L-1預處理細胞24, 48和72 h，取其中2塊板接受8 Gy的IR照射，另2塊板無IR處理，均繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，PBS洗3次，室溫下用4%甲醛固定15 min，0.2% Triton X-100處理10 min, PBS洗3次，10%血清37℃封閉30 min。用含1%BSA-0.1%Triton X-100的PBS按1∶500稀釋γ-H2AX一抗，4℃孵育過夜后，按1∶300稀釋羊抗鼠熒光標記二抗，室溫下避光封閉40 min。PBS洗后，用DAPI(0.1 mg·L-1)染色2 min，用抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察焦點形成情況。焦點形成的判定標準：① 無IR暴露條件下，以細胞核內焦點數(shù)>10者定為陽性細胞；② IR暴露條件下，因受照射細胞均有大量γ-H2AX焦點形成，根據(jù)焦點的形態(tài)不同將所觀察的細胞分成 A類和B類細胞，A類細胞內焦點較小而且亮度較弱， B類細胞內焦點較大且明亮。分別計數(shù)這兩類細胞，進行統(tǒng)計學分析。

1.6 MTT法檢測MCF7細胞存活取MCF7細胞制備細胞懸液，每孔接種6000個細胞于96孔板，每孔100 μL。培養(yǎng)過夜，除對照組外，分別用VPA 0.5和1 mmol·L-1預處理72 h，每個梯度設置6復孔，同時設調零孔和對照孔。IR 4 Gy組和IR+VPA 0.5和1 mmol·L-1組給予4 Gy的IR，照射后44 h，每孔加入含20 μL MTT的培養(yǎng)液120 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入150 μL DMSO，充分振搖10 min，酶標儀在波長490 nm處檢測吸光度值(A490 nm)，計算細胞存活率。細胞存活率(%)=實驗組A490 nm/對照組A490 nm×100%。

1.7 細胞克隆形成實驗取MCF7細胞消化制備細胞懸液接種至60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。對照組：按每皿500和1000個細胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；VPA 0.5 mmol·L-1組：按每皿500和1000個細胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中過夜，更換含VPA 0.5 mmol·L-1繼續(xù)培養(yǎng)24 h后換為新鮮培養(yǎng)液；IR 2, 4, 6 Gy組和IR+VPA 0.5 mmol·L-1組：按每皿500，1000，2000，4000，8000和16 000個細胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，過夜，IR+VPA 0.5 mmol·L-1組更換為含VPA 0.5 mmol·L-1繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨后兩組細胞分別給予3個劑量IR照射：2 Gy(每皿500，1000個細胞)、4 Gy(每皿2000，4000個細胞)和6 Gy(每皿8000，16 000個細胞)。上述4個處理組均同時設3個平行對照。培養(yǎng)15 d，當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見克隆時，用20%乙醇溶解稀釋甲素(結晶紫)至0.1%，用該甲紫溶液固定并染色細胞克隆30 min后，用去離子水沖洗3次，置空氣中干燥。倒置顯微鏡下計數(shù)≥50個細胞的克隆數(shù)，結果取平均值，并計算克隆形成率。克隆形成率(%)=每皿克隆數(shù)/每皿接種細胞數(shù)×100%。

1.8 流式細胞儀檢測細胞周期將細胞種于p60培養(yǎng)皿中過夜，除對照組外，分別給予VPA 0.5和1 mmol·L-1處理24，48和72 h，用胰酶消化和收集各組細胞，轉移至15 mL離心管中，1000×g離心5 min，棄上清，加入約5 mL PBS，混勻后1000×g離心5 min，棄上清。加70%冷乙醇，置于-20℃過夜后1000×g離心5 min,棄上清，PBS洗1次，再次1000×g離心5 min，棄上清。室溫下PI染液染色30 min，用流式細胞儀對細胞周期進行檢測。

2 結果

2.1 VPA對 IR誘導的γ-H2AX焦點形成的影響如圖1所示，VPA 0.5 mmol·L-1處理MCF7細胞24 h后，與正常對照組(圖1A1和1B1)相比，γ-H2AX焦點數(shù)目明顯增加(圖1A2和1B2)，焦點陽性率由5.3%顯著增加至10.8%(圖1C，P<0.05)；VPA處理48(圖1C)和72 h(圖1A3，1B3和1C)后，與正常對照組相比焦點陽性率進一步增加至12.6%(圖1C，P<0.01)和17.8%(圖1C，P<0.01)。即隨著處理時間延長，γ-H2AX焦點陽性率逐漸增高，呈時間依賴性(r=0.985, P<0.05)(圖1C)。VPA 1 mmol·L-1處理組γ-H2AX焦點陽性率變化趨勢與0.5 mmol·L-1相同，但比0.5 mmol·L-1組變化更為明顯(圖1C)。

單獨IR處理6 h后組(圖2A1和2B1)中, A類和B類細胞所占比例分別為83.5%和16.5%(圖2C)； VPA 0.5 mmol·L-1預處理24 h后(圖2A2和2B2)，與單獨IR組相比，A類細胞所占比例下降至71.1%(圖2C，P<0.05)，而B類細胞則顯著增加至28.9%(圖2C，P<0.05)；VPA預處理48(圖2C)和72 h(圖2A3, 2B3和2C)后, A類細胞比例進一步降低至42.0%和29.2%(圖2C,P<0.01)，而B類細胞比例則相應增加至58.0%和70.8%(圖2C，P<0.01)。即與單獨IR組相比，隨VPA預處理時間延長， A類細胞比例逐漸減少，而B類細胞比例逐漸增加，呈時間依賴性(r=0.986,P<0.05)。VPA 1 mmol·L-1預處理與0.5 mmol·L-1組有相同的變化趨勢(圖2C和2D)。

2.2 VPA對MCF7細胞存活率和克隆形成率的影響MTT結果顯示(圖3A1)，與正常對照組比較， VPA 0.5和1 mmol·L-1處理細胞72 h對細胞存活率無明顯影響。細胞克隆形成實驗顯示(圖3A2)，與正常對照組比較，VPA 0.5 mmol·L-1可顯著地降低細胞的克隆形成率(P<0.05)。提示VPA本身可影響細胞的生長。

為排除VPA本身對細胞生長的影響，在VPA對細胞放射敏感性影響實驗中，以單獨VPA處理細胞時的存活率(或克隆形成率)為基準，對MTT和細胞克隆形成實驗所得的VPA聯(lián)合IR的各組數(shù)據(jù)進行校正(圖3B1和3B2)。MTT結果顯示(圖3B1)，與單獨4Gy組比較，VPA 0.5和1 mmol·L-1預處理細胞72 h，再經4 Gy照射后48 h，細胞存活率顯著降低(P<0.05)。細胞克隆形成實驗顯示(圖3B2)，與單獨IR組比較，IR+VPA 0.5 mmol·L-1組可顯著地降低細胞的克隆形成率(P<0.05)，尤其VPA與4 Gy聯(lián)合組對細胞毒性作用最為明顯(P<0.01)，這一結果與MTT實驗結果一致。

2.3 VPA對MCF7細胞周期的影響流式細胞儀檢測結果顯示，與正常組相比，VPA 0.5和1 mmol·L-1處理MCF7細胞24，48和72 h后對細胞周期G1, S和G2/M期影響無統(tǒng)計學差異(圖4)。

3 討論

本研究結果顯示，VPA在治療癲癇病的安全血藥劑量及臨界劑量下均可致MCF7細胞內DNA雙鏈斷裂增加，且在上述劑量和作用時間條件下均未引起細胞周期改變。VPA預處理后顯著增加了IR誘導DNA雙鏈斷裂損傷的蓄積，抑制DNA損傷的修復及提高了IR對MCF7細胞的殺傷能力,提示VPA在安全血藥劑量范圍內能夠增加MCF7細胞對放射的敏感性，即具有放射增敏作用。本研究中細胞克隆形成實驗觀察到VPA可降低MCF7細胞克隆形成率，但MTT實驗并未觀察到VPA對MCF7細胞顯著的毒性作用，可能是MTT測定的是在相對較短時間內(1周內)的細胞毒性反應，而細胞克隆形成實驗則反映的是相對較長時間內(2～3周后)的細胞毒性反應，也說明單獨VPA對細胞的毒性作用可能具有一定的延遲性。此外，通過以單獨VPA處理細胞時的生存分數(shù)為基準校正了VPA聯(lián)合IR的數(shù)據(jù)，排除了VPA本身所產生的毒性對細胞放射增敏性的貢獻，也表明本研究結果具有可信性。近年來研究發(fā)現(xiàn)，VPA作為新型HDAC抑制劑可明顯增加其他多種腫瘤細胞的放射敏感性，VPA(或丙戊酸鈉)高濃度(1.5～8 mmol·L-1)預處理后給予IR比單純給予IR能明顯降低前列腺癌細胞DU-145、人紅白血病細胞株K562細胞、胃癌SGC-7901細胞和人腦膠質瘤細胞系SHG-44等多種腫瘤細胞的存活率[7-9]。Sha等[10]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度(5 mmol·L-1)VPA能使CHO33細胞DNA雙鏈斷裂增加、核內γ-H2AX焦點形成蓄積顯著增加。Kachhap等[7]研究還發(fā)現(xiàn)，高濃度的VPA (1.5 mmol·L-1)預處理前列腺DU-145腫瘤細胞后給予IR比單獨IR處理組能造成更多的γ-H2AX焦點形成在核內蓄積，這一報道與本研究的結果相一致。與其他類型的HDAC抑制劑相比，VPA在體內穩(wěn)定性好，雖然曲古抑菌素A等是天然強效的HDAC抑制劑，但由于在體內的不穩(wěn)定性而導致其失去臨床應用的可能。此外，VPA分子量小較容易通過血-腦脊液屏障，且具有顯著的神經元保護作用。因此，良好的生物利用度和低毒特性是對VPA放射增敏研究的明顯優(yōu)勢。本研究結果表明，VPA在其臨床安全血藥劑量即顯示出對乳腺癌細胞明顯的放射增敏作用，相比其他HDAC抑制劑更具有臨床應用價值。關于HDAC抑制劑對腫瘤細胞放射增敏的作用機制，現(xiàn)有的報道提出與細胞周期阻滯(G1期阻滯)的啟動、DNA合成被抑制、細胞凋亡和細胞自噬等機制有關[12-14]。Chen等[14]還提出，p53基因的狀態(tài)等可能是導致細胞對IR處理更敏感的原因。本研究發(fā)現(xiàn)，VPA臨床安全劑量(0.5 mmol·L-1)和安全臨界劑量(1 mmol·L-1)作用24～72 h都沒有引起細胞周期明顯變化，但卻能明顯地加重IR誘導的DNA雙鏈斷裂損傷，提示在臨床安全血藥劑量下VPA對乳腺癌細胞的放射增敏作用與細胞周期無關。此外，本研究中所用的乳腺癌細胞MCF7是細胞凋亡相關的胱天蛋白酶3基因缺失細胞系，胱天蛋白酶3基因缺失能導致MCF7細胞對IR誘導的細胞凋亡產生耐受[15]，間接提示本研究的VPA放射增敏作用也可能與細胞凋亡機制無關。結合本研究結果推測，DNA損傷修復障礙可能是VPA誘導細胞放射增敏的關鍵機制之一。同源重組和非同源末端連接是修復DNA雙鏈斷裂的兩種重要機制，VPA對這兩種修復機制的影響尚需更深入的研究。

[1] Shoji M, Ninomiya I, Makino I, Kinoshita J, Nakamura K, Oyama K,etal. Valproic acid, a histone deacetylase inhibitor, enhances radiosensitivity in esophageal squamous cell carcinoma[J].IntJOncol, 2012, 40(6):2140-2146.

[2] Purrucker JC, Fricke A, Ong MF, Rübe C, Rübe CE, Mahlknecht U. HDAC inhibition radiosensitizes human normal tissue cells and reduces DNA double-strand break repair capacity[J].OncolRep, 2010, 23(1):263-269.

[3] Adimoolam S, Sirisawad M, Chen J, Thiemann P, Ford JM, Buggy JJ. HDAC inhibitor PCI-24781 decreases RAD51 expression and inhibits homologous recombination[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2007, 104(49):19482-19487.

[4] Ji QL, Lin R, Shi XL, Mao YH, Zhai XG. Cytotoxicity and mechanisms of divalproex sodium and sodium valproate on HepG2 cells[J].ChinJPharmacolToxicol(中國藥理學與毒理學雜志), 2010, 24(3):214-218.

[5] Liu ZH, Liu YX, Li JF, Zhao Y, Liu YL, Tong Y,etal. Effect of suberoylanilide hydroxamic acid on survival and apoptosis of human paclitaxel-resistant ovarian cancer OC3/P cells[J].ChinJPharmacolToxicol(中國藥理學與毒理學雜志), 2013, 27(6):966-970.

[6] Debeb BG, Xu W, Mok H, Li L, Robertson F, Ueno NT,etal. Differential radiosensitizing effect of valproic acid in differentiationversusself-renewal promoting culture conditions[J].IntJRadiatOncolBiolPhys, 2010, 76(3):889-895.

[7] Kachhap SK, Rosmus N, Collis SJ, Kortenhorst MS, Wissing MD, Hedayati M,etal. Downregulation of homologous recombination DNA repair genes by HDAC inhibition in prostate cancer is mediated through the E2F1 transcription factor[J].PLoSOne, 2010, 5(6):e11208.

[8] Chen XP, Chu JJ, Wang ZC. Radiosensitivity of valproic acid on gastric carcinoma cell line SGC-7901[J].PractJCancer(實用癌癥雜志), 2013, 28(3):227-229.

[9] Su J, Chu JJ, Ren F, Wang ZC, Chen XP. Enhancement of human glioma carcinoma cell line SHG-44 radiosensitivity by valproic acid[J].JPractMed(實用 醫(yī)學雜志), 2013, 29(2):296-299.

[10] Sha K, Winn LM. Characterization of valproic acid-initiated homologous recombination[J].BirthDefectsResBDevReprodToxicol, 2010, 89(2):124-132.

[11] Bolden JE, Peart MJ, Johnstone RW. Anticancer activities of histone deacetylase inhibitors[J].NatRevDrugDiscov, 2006, 5(9):769-784.

[12] Robert T, Vanoli F, Chiolo I, Shubassi G, Bernstein KA, Rothstein R,etal. HDACs link the DNA damage response, processing of double-strand breaks and autophagy[J].Nature, 2011, 471(7336):74-79.

[13] Shubassi G, Robert T, Vanoli F, Minucci S, Foiani M. Acetylation: a novel link between double-strand break repair and autophagy[J].CancerRes, 2012, 72(6):1332-1335.

[14] Chen X, Wong P, Radany E, Wong JY. HDAC inhibitor, valproic acid, induces p53-dependent radiosensitization of colon cancer cells[J].CancerBiotherRadiopharm, 2009, 24(6):689-699.

[15] Essmann F, Engels IH, Totzke G, Schulze-Osthoff K, J?nicke RU. Apoptosis resistance of MCF-7 breast carcinoma cells to ionizing radiation is independent of p53 and cell cycle control but caused by the lack of caspase-3 and a caffeine-inhibitable event[J].CancerRes, 2004, 64(19):7065-7072.

(本文編輯: 喬 虹)

Effect of valproic acid on radiosensitivity to breast cancer cells

ZHAO Xi-peng, LUO Yue, DONG Chao, ZHANG Feng-mei, FENG Zhi-hui

(DepartmentofEnvironmentalHealth,SchoolofPublicHealth,ShandongUniversity,Jinan250012,China)

OBJECTIVE To study the effect of valproic acid (VPA) on radiosensitivity to MCF7 breast cancer cells. METHODS MCF7 cells were pretreated with VPA 0.5 and 1 mmol·L-1for 0, 24, 48 and 72 h respectively, irradiated with 8 Gy IR, and at 6 h post-IR, the γ-H2AX foci formation in MCF7 cells was tested by immunofluorescence assay. MCF7 cells were pretreated with VPA 0.5 and 1 mmol·L-1for 72 h, irradiated with 4 Gy IR, and at 48 h post-IR, the cell survival rate was detected by MTT assay. MCF7 cells were pretreated with VPA 0.5 mmol·L-1for 24 h, and then irradiated according to the amount of cells: 2 Gy (500 and 1000 cells per plate), 4 Gy (2000 and 4000 cells per plate), 6 Gy (8000 and 16000 cells per plate), and the cloning efficiency was calculated. MCF7 cells were pretreated with VPA 0.5 and 1 mmol·L-1for 0, 24, 48 and 72 h respectively and the cell cycle profile was analyzed via flow cytometry. RESULTS After treatment with VPA alone for 24 h, MCF7 cells showed a significant increase in the amount of γ-H2AX foci formation(P<0.01). It was also found that VPA increased IR-induced γ-H2AX foci formation, which obviously prolonged the pretreatment time of VPA(P<0.01) in a time-dependent manner(r=0.98,P<0.05). VPA 0.5 and 1 mmol·L-1had the same effect on γ-H2AX foci formation. Furthermore, VPA was able to cause a significant decrease in IR-induced clonogenic survival but an increase in IR-induced cytotoxicity by MTT assay. Also, VPA alone decreased the plating efficiency of MCF7 cells. However, the cycle profile of MCF7 cells treated with both VPA 0.5 and 1 mmol·L-1was not changed. CONCLUSION Without affecting the cell cycle profile, both the safe and critical dose of VPA used in clinical epilepsy treatment can significantly increase the accumulation of DNA double strand breaks in the cells and sensitize the cells to IR treatment, suggesting that VPA can induce radiosensitization of breast cancer cells.Key words: valproic acid; breast cancer; DNA damage; radiosensitivity; cell cycle

FENG Zhi-hui, E-mail: fengzhihui@sdu.edu.cn, Tel: (0531)88382137

國家自然科學基金(81172527); 國家自然科學基金項目(81472800)；山東省科技發(fā)展計劃(2013GGE27052)

趙錫鵬(1988-)，男，碩士研究生，主要從事DNA損傷修復的分子機制與放射毒理研究。

鳳志慧，E-mail: fengzhihui@sdu.edu.cn, Tel: (0531)88382137

Foundation item: The project supported by National Natural Science Foundation of China(81172527); National Natural Science Foundation of China(81472800); and Science and Technology Program of Shandong Province(2013GGE27052)

2014-05-31 接受日期: 2015-02-17)

R979.1

A

1000-3002(2015)02-0247-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.010

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