促性腺激素釋放激素在雌二醇誘導(dǎo)的大鼠青春期啟動(dòng)提前中的作用

華辰鳳, 楊 嶸, 劉羽欣, 黃麗娜, 張 麗, 張?zhí)砉? 田冬冬, 趙 君, 趙增明, 王以美, 彭雙清

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制研究所毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究中心, 北京 100071)

促性腺激素釋放激素在雌二醇誘導(dǎo)的大鼠青春期啟動(dòng)提前中的作用

華辰鳳, 楊 嶸, 劉羽欣, 黃麗娜, 張 麗, 張?zhí)砉? 田冬冬, 趙 君, 趙增明, 王以美, 彭雙清

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制研究所毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究中心, 北京 100071)

目的 探討促性腺激素釋放激素(GnRH)在雌二醇(E2)誘導(dǎo)大鼠青春期啟動(dòng)提前中的作用。方法 18日齡雌性SD大鼠分別經(jīng)口給予玉米油和E250 μg·kg-1，連續(xù)給藥5 d。觀察大鼠陰道開口時(shí)間及卵巢組織變化；Western蛋白印跡法檢測(cè)下丘腦的GnRH、G蛋白偶聯(lián)受體54(GPR54)和磷脂酶C(PLC)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與玉米油對(duì)照組相比，E2組大鼠陰道開口時(shí)間顯著提前約12.2 d(P<0.01)。卵巢組織切片可見黃體，且下丘腦GnRH, GPR54和PLC蛋白表達(dá)水平分別增加47%, 55%和56%(P<0.05)。結(jié)論 E2誘發(fā)的大鼠青春期啟動(dòng)時(shí)間提前可能與調(diào)節(jié)下丘腦GnRH, GPR54和PLC表達(dá)相關(guān)。

雌二醇; 青春, 早熟; 促性腺激素釋放激素

雌二醇(estradiol，E2)是由卵巢和大腦神經(jīng)元合成分泌的性激素，參與促進(jìn)女性內(nèi)外生殖器官發(fā)育和維持女性性功能及第二性征。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，畜禽產(chǎn)品中檢出的 E2以及類雌激素樣物質(zhì)被認(rèn)為可能是引起嬰幼兒性早熟的一個(gè)原因，但具體機(jī)制尚不明確。青春期發(fā)育啟動(dòng)受下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA)調(diào)控，其中下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)脈沖式釋放，是青春期啟動(dòng)的分子閥門[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦G蛋白偶聯(lián)受體54(G protein-coupled receptor 54，GPR54)可激活細(xì)胞內(nèi)第二信使磷脂酶C(phospholipase C，PLC)，調(diào)節(jié)GnRH的表達(dá)，被認(rèn)為是青春期發(fā)育啟動(dòng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)[3]。本研究旨在探討GnRH, GPR54和PLC在E2誘導(dǎo)大鼠青春期啟動(dòng)提前中的作用，為探討類雌激素樣作用的外源性物質(zhì)引起性早熟機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

市售精制玉米油購自北京華聯(lián)超市，金龍魚河北省秦皇島金海食品工業(yè)有限公司生產(chǎn)；17β-E2購自美國Cayman公司；β肌動(dòng)蛋白、GnRHⅠ和GPR54抗體均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；PLC抗體購自英國Abcam公司；WIP組織細(xì)胞裂解液(tissue and cell lysis solution for Western blotting and immunoprecipitation)購自北京賽馳生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SuperECL Plus 超敏發(fā)光液、脫脂奶粉和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體均購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidine difluoride，PVDF) 膜購自美國Millipore公司；X線膠片購自美國Kodak公司。TBST緩沖液(mmol·L-1，pH 7.4～7.5)：Tris-HCl 20， NaCl 140；0.05%Tween-20。CR3i型低溫高速冷凍離心機(jī)和MK3型多功能酶標(biāo)儀(上海Thermo公司)；BT224S型電子天平(德國Sartorius公司)；CKX41型倒置顯微鏡(美國ABI公司)。

1.2 動(dòng)物SPF級(jí)SD未孕大鼠，雌、雄各20只，體質(zhì)量250～300 g(雌)、300～350 g(雄)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK-(軍)2007-004。飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所SPF級(jí)大鼠動(dòng)物房，恒溫(22～26℃)、恒濕(40%～70%)，自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)方法均遵循NIH制定的關(guān)于動(dòng)物飼養(yǎng)和使用的規(guī)定并得到軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)和使用管理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 合籠動(dòng)物分組及給藥雌雄大鼠1∶1合籠交配，自由飲食。孕鼠單籠飼養(yǎng)，產(chǎn)后，選用雌性仔鼠，由親鼠自養(yǎng)。雌仔鼠在出生18日齡(postnatal day 18，PND18)時(shí)予以標(biāo)記編號(hào)，按照窩別區(qū)組及體質(zhì)量隨機(jī)分組分為玉米油對(duì)照組和E2處理組(E2組)，每組8只。玉米油對(duì)照組和E2組大鼠灌胃容量為2.5 mL·kg-1，每天1次，連續(xù)5 d[4-5]。PND21仔鼠斷奶。

1.4 一般指標(biāo)觀察自給藥開始當(dāng)日，每日稱量并記錄大鼠體質(zhì)量，觀察大鼠死亡率、發(fā)病率和一般的臨床表現(xiàn)并及時(shí)記錄異常情況，觀察項(xiàng)目主要包括：行為、皮膚、毛發(fā)、眼睛、黏膜、分泌物、排泄物和自主活動(dòng)(如流淚、毛發(fā)直立、瞳孔大小、異常的呼吸模式)等，持續(xù)觀察至大鼠處死當(dāng)日。

1.5 觀察大鼠陰道開口時(shí)間自給藥開始當(dāng)日，每日檢查陰道開口，記錄陰道開口時(shí)間，觀察至大鼠處死。

1.6 臟器系數(shù)測(cè)定及卵巢組織學(xué)檢查大鼠于末次染毒后48 h頸椎脫臼處死，取下丘腦、卵巢和子宮。卵巢稱重后用10%甲醛固定；下丘腦稱重后置于凍存管內(nèi)，迅速置液氮中冷凍，然后置于-80℃冰箱中備用。臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。卵巢組織固定，24 h后修片、脫水、石蠟包埋，沿卵巢組織長軸切片，HE染色，觀察各期卵泡形態(tài)并計(jì)算每側(cè)黃體出現(xiàn)率。

1.7 Western蛋白印跡法檢測(cè)下丘腦組織勻漿中GnRH, GPR54和PLC蛋白的表達(dá)水平將凍存于-80℃的各組大鼠下丘腦取出，按每 20 mg組織加100～200 μL的比例加入WIP。用組織細(xì)胞勻漿器勻漿直至蛋白充分裂解。冰浴30 min(每10 min，渦旋振蕩1次，每次10 s)后，4℃離心(14 000×g 5 min)，取上清，即得到相應(yīng)蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白定量，電泳中每份樣品上樣量為20 μg。轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉1 h，用5%脫脂奶粉稀釋一抗孵育PVDF膜，保持4℃低溫過夜。用TBST洗膜3次后，加入二抗室溫孵育1.5 h，3次洗膜后，用ECL系統(tǒng)在X線膠片上顯影。膠片掃描后，使用Image J分析軟件對(duì)全部實(shí)驗(yàn)條帶進(jìn)行灰度分析，以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)， 以目標(biāo)蛋白條帶積分吸光度值與對(duì)應(yīng)樣品的β肌動(dòng)蛋白積分吸光度值比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 雌二醇對(duì)大鼠一般狀態(tài)的影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，兩組大鼠均無異常死亡，進(jìn)食及飲水均未見異常，且生長狀況良好。給藥期間，隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長，大鼠體質(zhì)量逐漸增加，兩組組間體質(zhì)量隨時(shí)間變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1)。

2.2 雌二醇對(duì)雌性大鼠陰道開口時(shí)間的影響大鼠自給藥到處死，僅觀察到E2組大鼠陰道開口，而玉米油對(duì)照組大鼠觀察至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)陰道仍未開口。此外，參照本實(shí)驗(yàn)室前期相關(guān)研究結(jié)果，玉米油處理組大鼠陰道開口時(shí)間為(34.7±1.0)日齡[5]，E2組大鼠陰道開口時(shí)間為〔(22.5±0.5)日齡〕，與玉米油處理組提前約12.2 d(n=8，P<0.01)。

2.3 雌二醇對(duì)雌性大鼠卵巢和子宮臟器系數(shù)的影響如表1所示，與玉米油對(duì)照組相比，E2組子宮系數(shù)顯著增加153%(P<0.05)；而玉米油組卵巢系數(shù)無顯著性差異。

Tab.1 Effect of E2on reproductive organs of female rats

GroupIndicesoforgan/mg·g-1OvaryUterusCornoil0．49±0．060．38±0．04E250μg·kg-10．47±0．020．96±0．17?

2.4 雌二醇對(duì)雌性大鼠卵巢組織的影響如圖2所示，玉米油對(duì)照組可見各期卵泡，但未見黃體(圖2A)；而E2組不僅可見各期卵泡，而且可見黃體(圖2B)。E2組每張組織切片可見黃體(1.9±0.8)個(gè)，與玉米油對(duì)照組相比明顯增加(P<0.05)。

Fig.2 Histological changes of ovary treated with E2(HE ×200). A: corn oil group; B: E2group. The arrow indicates the corpus luteum.

2.5 雌二醇對(duì)雌性大鼠下丘腦組織勻漿中GnRH，GPR54和PLC蛋白表達(dá)水平的影響Western蛋白印跡(圖3A)及其定量結(jié)果(圖3B)顯示，與玉米油對(duì)照組相比，E2組大鼠下丘腦GnRH, GPR54和PLC蛋白表達(dá)水平均顯著增加，分別增加47%, 55%和56%(P<0.05)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，E2可使大鼠陰道開口時(shí)間顯著提前，子宮系數(shù)顯著增加，卵巢黃體提前生成，提示E2可誘發(fā)大鼠青春期提前啟動(dòng)；另外，E2可以促進(jìn)大鼠下丘腦GnRH，GPR54和PLC的表達(dá)，提示下丘腦GnRH，GPR54和PLC可能參與E2誘導(dǎo)大鼠青春期啟動(dòng)提前過程中的調(diào)控。青春期啟動(dòng)是一個(gè)復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌過程，主要由HPGA所調(diào)控。當(dāng)雌性大鼠發(fā)育到一定階段，作為HPGA啟動(dòng)的始動(dòng)因子GnRH合成分泌開始增加，進(jìn)而刺激垂體節(jié)律性的分泌卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)和黃體生成素(luteinizing hormone，LH)來促進(jìn)性腺分泌雌激素和睪酮等激素[6]，從而調(diào)節(jié)青春期發(fā)育過程中的性器官發(fā)育；其中陰道開口通常作為判斷雌性大鼠青春期啟動(dòng)的外在標(biāo)志[7]，子宮重量的增加、卵巢黃體的生成可作為青春期趨于性成熟的外在表征[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E2組大鼠陰道開口時(shí)間提前，這與Hilakivi-Clarke等[9]研究中E220 μg·kg-1可引起大鼠性早熟相一致；考慮到玉米油作為賦形劑可能具有雌激素作用影響大鼠青春期啟動(dòng)，因此，本實(shí)驗(yàn)室在預(yù)實(shí)驗(yàn)中設(shè)立了陰性對(duì)照組。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，延長了玉米油對(duì)照組給藥后的觀察時(shí)間，發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照組與玉米油對(duì)照組大鼠陰道開口時(shí)間均約為34 d，且與文獻(xiàn)查閱正常大鼠陰道開口時(shí)間一致，提示玉米油作為賦形劑對(duì)大鼠青春期沒有明顯影響。由于大鼠卵巢、子宮和陰道組織上也有豐富的雌激素受體表達(dá)，而本研究中E2組大鼠子宮重量明顯增加且卵巢中發(fā)現(xiàn)黃體，這一結(jié)果不能證明E2對(duì)大鼠卵巢、子宮和陰道的作用是直接的還是誘發(fā)青春期啟動(dòng)，即通過HPGA調(diào)控陰道、子宮和卵巢發(fā)育的。但是，基于本實(shí)驗(yàn)室相關(guān)研究結(jié)果[5]，血清中LH與FSH顯著增加，且LH與FSH的比值>1為真性性早熟，提示一定量的E2可能是大鼠青春期啟動(dòng)提前即HPGA提前啟動(dòng)的一個(gè)誘因。本研究結(jié)果顯示，E2處理組中作為HPGA啟動(dòng)的始動(dòng)因子GnRH蛋白表達(dá)水平顯著增加，這提示E2誘發(fā)青春期啟動(dòng)可能是通過影響下丘腦GnRH的合成和分泌來促發(fā)HPGA提前啟動(dòng)來完成的。近年來研究表明，E2可通過下丘腦前腹側(cè)室旁核雌激素受體α介導(dǎo)kiss-1基因編碼kisspeptins，參與GnRH的分泌[10]；與本研究結(jié)果E2處理組大鼠下丘腦GnRH蛋白表達(dá)水平顯著增加相一致。另外研究發(fā)現(xiàn)，kisspeptins可與GnRH神經(jīng)元上的GPR54結(jié)合，激活GnRH神經(jīng)元分泌GnRH，提示GPR54可能是E2誘發(fā)青春期啟動(dòng)提前引起GnRH分泌的一個(gè)關(guān)鍵[11]。GPR54作為kisspeptins的特異性受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體，根據(jù)近年來GPR54定位的研究發(fā)現(xiàn)，GPR54在各種組織中廣泛表達(dá)，以下丘腦、胚胎和胰腺等表達(dá)最高，并且存在于下丘腦GnRH神經(jīng)元上，參與GnRH的分泌[12]。因此，本研究在上述研究結(jié)果的前提下進(jìn)一步探討E2對(duì)下丘腦GPR54表達(dá)水平的影響。本研究中，E2處理組大鼠下丘腦GPR54蛋白表達(dá)水平顯著增加，證實(shí)了一定劑量的E2可促進(jìn)下丘腦GPR54的表達(dá)。基于本實(shí)驗(yàn)室前期相關(guān)研究結(jié)果，E2可引起編碼kisspeptins的kiss-1 mRNA表達(dá)增加[5]，因此，筆者推測(cè)E2可能通過kiss-1神經(jīng)元上的ERα受體介導(dǎo)kiss-1神經(jīng)元編碼表達(dá)kisspeptins，然后kisspeptins與GnRH神經(jīng)元上的GPR54結(jié)合，激活GnRH神經(jīng)元分泌GnRH[13]調(diào)節(jié)青春期啟動(dòng)與發(fā)育，而這可能是E2引起GnRH分泌和青春期啟動(dòng)的路徑之一。相關(guān)研究表明，kisspeptins與GnRH神經(jīng)元上的GPR54結(jié)合后，可激活 PLC，致磷脂酰肌醇積聚和Ca2+動(dòng)員等一系列胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使GnRH表達(dá)增加[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在E2可引起下丘腦GnRH及GPR54蛋白表達(dá)水平增高的基礎(chǔ)上，E2處理組PLC蛋白表達(dá)水平顯著增加，提示E2誘發(fā)青春期提前啟動(dòng)過程中，可能是通過促進(jìn)GPR54表達(dá)后，使PLC活化增加，進(jìn)而促進(jìn)GnRH表達(dá)使HPGA提前啟動(dòng)。可見，下丘腦神經(jīng)元GPR54-PLC-GnRH在E2調(diào)控青春期啟動(dòng)與發(fā)育的過程中發(fā)揮著重要作用，但由于青春期的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，下丘腦GPR54-PLC-GnRH與E2引起青春期啟動(dòng)和發(fā)育過程中還有更多的作用機(jī)制和調(diào)控路徑有待于進(jìn)一步研究。

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(本文編輯: 喬 虹)

第七次全國毒理學(xué)大會(huì)會(huì)議通知

由中國毒理學(xué)會(huì)主辦的第七次全國毒理學(xué)大會(huì)(CSOT-Ⅶ)將于2015年10月25-28日在湖北省武漢市東湖賓館國際會(huì)議中心召開。本次大會(huì)主題：協(xié)同創(chuàng)新，驅(qū)動(dòng)毒理學(xué)發(fā)展。大會(huì)網(wǎng)站http://www.chntox.org/csot7/cn/現(xiàn)已開通，接受網(wǎng)上投稿和注冊(cè)。全國毒理學(xué)大會(huì)是中國毒理學(xué)領(lǐng)域最高層次學(xué)術(shù)盛會(huì)，此次大會(huì)將邀請(qǐng)國內(nèi)外知名專家和學(xué)者就毒理學(xué)領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展、前沿理論與技術(shù)發(fā)展做大會(huì)報(bào)告，中國毒理學(xué)會(huì)熱誠歡迎我國毒理學(xué)和相關(guān)領(lǐng)域的專家、學(xué)者、科技和教育工作者、管理人員、研究生以及相關(guān)企業(yè)工程技術(shù)人員等踴躍投稿，積極參加會(huì)議，展示學(xué)術(shù)成果。大會(huì)期間還將舉辦相關(guān)科技產(chǎn)品、試劑和儀器等毒理科技展覽，歡迎生物和醫(yī)藥科技企業(yè)和廠家等參展。此外，還將根據(jù)廣大會(huì)員對(duì)專業(yè)知識(shí)更新的需求，舉辦相關(guān)的新技術(shù)、新方法、新理論的繼續(xù)教育培訓(xùn)班，邀請(qǐng)國內(nèi)外著名毒理學(xué)專家主講。大會(huì)征集和交流的學(xué)術(shù)論文將涵蓋毒理學(xué)和相關(guān)學(xué)科領(lǐng)域的科研和管理等內(nèi)容的研究論文，截止日期為2015年8月15日。摘要格式具體要求：① 論文摘要1000字以內(nèi)(不少于600字)。② 所提交的論文摘要必須尚未在雜志上公開發(fā)表，論文摘要包括論文的題目、作者、單位和電子郵箱地址，論文摘要內(nèi)容采用結(jié)構(gòu)式摘要，包括目的、材料和方法、結(jié)果、結(jié)論。綜述性文章摘要可按照論述式撰寫。文字表達(dá)應(yīng)符合科學(xué)論文一般規(guī)范要求，表達(dá)要求準(zhǔn)確、簡潔明了，真實(shí)反映研究結(jié)果。使用代號(hào)或縮寫應(yīng)有相關(guān)說明(保密內(nèi)容由作者處理，文責(zé)自負(fù))。聯(lián)系人：孔祥穎；地址：北京市海淀區(qū)太平路27號(hào)中國毒理學(xué)會(huì)；郵編：100850電話：(010)66932387(辦)；E-mail: cst@chntox.org

Role of gonadotropin-releasing hormone on advancing ratpuberty onset induced by estradiol

HUA Chen-feng, YANG Rong, LIU Yu-xin, HUANG Li-na, ZHANG Li, ZHANG Tian-guang,TIAN Dong-dong, ZHAO Jun, ZHAO Zeng-ming, WANG Yi-mei, PENG Shuang-qing

(EvaluationandResearchCentreforToxicology,InstituteofDiseasePreventionandControl,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100071,China)

OBJECTIVE To investigate the role of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) in estradiol(E2) induced advance of puberty onset in rats. METHODS Postnatal day 18 SD rats were given a daily intragastric administration of corn oil or E2(50 μg·kg-1) for consecutive 5 d. The day of vaginal opening (VO), pathological changes in ovary and protein expression levels of GnRH, G protein-coupled receptor 54 (GPR54) and phospholipase C (PLC) in hypothalamus were observed. RESULTS As compared to corn oil controll group, VO was advanced by about 12.2 d, corpus luteum was observed in the ovary section, and the protein expression levels of GnRH,GPR54 and PLC in hypothalamus were significantly increased by 47%, 55% and 56% in E2group, respectively. CONCLUSION E2induced onset of puberty advance may be closely related to regulation of the expression of GnRH, GPR54 and PLC in hypothalamus. Key words: estradiol; puberty, precocious; gonadotropin-releasing hormone

PENG Shuang-qing, E-mail: pengsq@hotmail.com, Tel: (010)66948462

國家自然科學(xué)基金(81172699)

華辰鳳，女，碩士研究生，主要從事藥物安全與食品衛(wèi)生研究；彭雙清(1962-)，男，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事藥物安全與食品衛(wèi)生研究。

彭雙清, E-mail: pengsq@hotmail.com, Tel: (010)66948462

Foundation item: The project supported by National Natural Science Foundation of China (81172699)

2014-11-04 接受日期: 2015-03-15)

R977.1

A

1000-3002(2015)02-0260-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.02.012

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