生殖系統氧化應激損傷的動物實驗方法研究進展

李堂林，翁治委(綜述)，周少虎(審校)

(廣州中醫藥大學第一附屬醫院生殖醫學科，廣州 510405)

生殖系統氧化應激損傷的動物實驗方法研究進展

李堂林△，翁治委△(綜述)，周少虎※(審校)

(廣州中醫藥大學第一附屬醫院生殖醫學科，廣州 510405)

活性氧類(reactive oxygen species，ROS)是機體正常新陳代謝過程中產生的一組具有比氧氣更強氧化能力的含氧活性物質的統稱。在正常精液的新陳代謝過程中，活性氧與精液抗氧化系統處于平衡狀態，當精液中ROS生成過多或抗氧化系統相對貧乏時,產生的ROS不能及時清除，導致ROS蓄積，便形成氧化應激。

目前，生殖系統氧化應激損傷的評估大多數以精液常規參數——精液濃度、精子活力及精子形態為基礎，并結合生化檢測如氧自由基、谷胱甘肽、丙二醛、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、谷胱甘肽轉移酶(glutathione-S-transferase，GST)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)以及精子DNA完整性等綜合評價。

現階段，生殖系統氧化應激研究及學說尚未完全成熟，尤其是在國內，相關研究報道較少。動物實驗是研究病理生理機制及藥理學實驗方面不可或缺重要手段，現對近年來研究精液氧化應激的動物實驗方法進行歸納，以期為臨床研究提供基礎。

1重金屬污染物

1.1鎘鎘是一種重金屬，生殖器官睪丸、卵巢對鎘損傷非常敏感。鎘對氨基酸的硫醇基特別是半胱氨酸有較強的親和力，可導致谷胱甘肽水平下降，脂質過氧化增加、細胞間穩定性改變、DNA和細胞膜損傷，最終導致細胞死亡[1-2]。

腹腔注射或胃腸道接觸氯化鎘均可造成生殖系統氧化應激損傷。使用氯化鎘(1 mg/kg)單次維斯塔大鼠腹腔注射，56 d后發現精液受到氧化應激損傷[1]。氯化鎘(1 mg/kg)連續腹腔注射SD大鼠3 d，可增加脂質過氧化物標志物硫代巴比妥酸反應物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)的水平，降低SOD、CAT、GPx及谷胱甘肽的水平，從而形成急性氧化應激狀態[2]。

給予維斯塔大鼠氯化鎘大劑量(30 mg/kg)口服，每周5次，連續8周，可導致睪丸組織形態學改變，細胞凋亡增加，丙二醛活性增強，抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性降低,造成生殖系統氧化應激損傷[3]。

1.2鎳鎳是日常生活中經常接觸到的一種金屬，廣泛存在于生活的各個方面。鎳的毒性作用與其引起的氧化應激有關：小鼠腹腔注射不同劑量的氯化鎳(0.625、1.250、2.500、5.000 μmol/100 g)，連續3 d或5 d，可在中、高劑量組形成氧化應激損傷[4]。不同實驗動物對鎳所造成的氧化應激損傷的敏度性有所差異，以5 mg/kg的氯化鎳分別對大鼠和小鼠進行腹腔注射，48 h后僅觀察到小鼠的精漿發生氧化應激損傷[5]。

2香煙煙霧暴露

香煙的煙霧包含大量有害物質,如尼古丁、一氧化碳、致癌物質以及致突變物質等，這些物質或其代謝產物均可出現在精漿中，并引起生殖毒性，進而導致精子質量下降。香煙煙霧暴露(每日20支，以30 min 10只的速度，間隔10 min)連續9 d可造成精液氧化應激：丙二醛和硫醇基(-SH)水平增加、SOD活性增強，精子濃度、活力、活率及正常形態均降低，精子DNA碎片率增加[6]。

3有機工業污染物

3.1四溴聯苯醚四溴聯苯醚是多溴聯苯醚的一種，是一種有害的有機環境污染物，其被廣泛用于紡織品、家具及電子產品等生產中。給予SD大鼠四溴聯苯醚[0.001、0.03、1 mg/(kg·d)]灌胃，每周連續6 d，連續8周后使用熒光免疫檢驗法發現，大鼠精液中ROS的水平明顯升高，且氧化應激程度與四溴聯苯醚用藥濃度呈正相關[7]。

3.2溴氰菊酯溴氰菊酯是合成除蟲菊酯類殺蟲劑的一種，其被廣泛用于農業殺蟲。溴氰菊酯1 mg/kg大鼠腹腔注射連續21 d，可造成精漿一氧化氮和丙二醛水平增加、精子DNA完整性損害、細胞凋亡增加，形成氧化應激損傷睪丸組織[8]。

3.3四氯二苯并二惡英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)TCDD是一種高毒性的環境有機污染物，其具有生殖、發育毒性，內分泌、代謝毒性及致癌性等。SD大鼠口服TCDD每周 2 μg/kg，連續45 d，精液中SOD、GSH、CAT、GPx的水平明顯降低，附睪精子密度、活力下降，精子畸形率增加，并認為TCDD通過結合并激活細胞溶質中的抗透明質酸酶而激活酶樣細胞色素P4501A1，從而引起精液氧化應激[9]。

3.4乙二醇乙基醚(ethylene glycol monoethyl ether，EGEE)EGEE具有慢性生殖和血液毒性。給予雄性維斯塔大鼠EGEE(100、200、400 mg/kg)口服，連續14 d后，200 mg/kg和400 mg/kg組維斯塔大鼠睪丸、附睪中GSH水平降低，SOD、CAT活性下降，丙二醛、GST、LDH水平增加，病理檢查證實睪丸退化[10]。

4脂多糖

脂多糖是革蘭陰性菌死亡后釋放的一種內毒素，大鼠腹腔注射脂多糖(5 mg/kg)24 h后即可引起睪丸生精功能障礙，睪丸內丙二醛、一氧化氮水平增加，DNA損傷標志物8-羥基脫氧鳥苷水平升高，還原型谷胱甘肽和LDH-x水平降低，進而導致睪丸組織損傷、精子數量和活力降低[11]。脂多糖腹腔注射后能通過免疫反應擾亂血-睪屏障，增加白細胞滲透性，導致精液中白細胞增多，進而產生過多的ROS，并激活一氧化氮合酶[11]。

體外試驗發現，成年大鼠的Sertoli細胞與脂多糖(5、10、20 μg/mL)一起孵育后，過氧化氫生成增加，抗氧化酶和谷胱甘肽水平明顯下降，從而形成氧化應激狀態并損傷Sertoli細胞功能(乳酸鹽產物增多、LDH、γ谷氨酰胺轉肽酶、β葡糖醛酸糖苷酶活性下降)，且損傷程度與脂多糖劑量呈正相關[12]。

5氫過氧化物

目前，用于動物生殖系統氧化應激實驗的過氧化氫物主要有叔丁基氫過氧化氫(t-butyl hydroperoxide，tbHP)、過氧化氫枯烯(cumene hydroperoxide，cHP)和過氧化氫3種。tbHP可作為生物體內多個系統氧化應激的誘導劑[13]。tbHP在小鼠內以1∶10 半數致死量(median lethal dose,LD50)腹腔注射連續2周，睪丸和精液中O2-和H2O2的水平明顯升高，精子數量及活力降低，睪丸萎縮、曲細精管中精子減少[14]。tbHP造成的氧化應激可能是tbHP導致谷胱甘肽水平降低所致。SD大鼠腹腔注射H2O21 mg/kg，隔日1次，連續10周，精液中GST水平明顯升高，精子活力和精卵結合功能受損(胰蛋白酶降低)、生精受到抑制(人肌動蛋白素2升高)、精子凋亡增加(親環蛋白A升高)；蛋白質合成損傷(熱激蛋白升高)[15]。氫過氧化物造成的氧化應激具有劑量-時間依賴性：維斯塔大鼠腹腔單次(1/40、1/20、1/10 LD50)注射氫過氧化物(tbHP和cHP)并不能造成大鼠睪丸和附睪內的氧化應激損傷，但連續腹腔注射1或2周能導致大鼠睪丸、附睪內氧化應激水平升高，且氧化應激程度與氫過氧化物劑量呈正比[16]。

在體外，維斯塔大鼠睪丸細胞組織懸液和睪丸外植組織與氫過氧化物(tbHP和cHP，濃度：100 μmol/L)共孵育，可造成睪丸細胞組織懸液和睪丸外植組織脂質過氧化顯著增加，抗氧化酶(CAT和GPx)活性抑制，谷胱甘肽水平降低，且氧化應激程度與共同孵育時間和藥物濃度呈正相關[17]。

6內分泌激素

6.1炔雌醇炔雌醇通過引起睪丸內氧化應激損傷，打亂睪丸細胞增殖與凋亡的平衡，擾亂性類固醇分泌，引起生精紊亂。SD大鼠口服炔雌醇3 mg/(kg·d)，連續14 d，可形成精液氧化應激損傷，精子數量及活力降低，Sertoli細胞和生精細胞數量減少、排列紊亂，精子凋亡增加[18]。

6.2瘦素瘦素是脂肪組織產生的一種激素，其在生殖系統能量平衡和新陳代謝中具有重要作用。SD大鼠腹腔注射瘦素(10、30 μg/kg)連續7 d或15 d，可造成精子ROS和精子DNA碎片增加，精子常規參數下降[19]。

6.3男性避孕藥AdjudinAdjudin是一種不影響男性激素分泌的男性避孕藥，其通過阻礙生精細胞的生長而達到避孕的目的。維斯塔大鼠口服Adjudin 40 mg/kg，在短期內(4～7 d)即可造成睪丸內氧化應激損傷，表現為過氧化氫量和脂質過氧化增加，SOD、CAT、GPx、GPS等抗氧化酶活性降低；但長時間(15～30 d)應用，氧化應激則不明顯[20]。

7鏈脲霉素

維斯塔大鼠單次腹腔注射鏈脲霉素(60 mg/kg)，可造成大鼠睪丸、附睪中TBARS、丙二醛水平升高，GSH、維生素E、CAT、GPx、谷胱甘肽還原酶、SOD水平降低，睪丸組織損傷，該損傷在腹腔注射后2周開始出現，并呈持續性[21]。

8右腎靜脈部分阻斷

精索靜脈曲張是造成男性不育的原因之一，其通過引起生殖系統組織缺氧而造成氧化應激損傷[22]。

右腎靜脈部分阻斷可造成SD大鼠精索靜脈曲張模型。右腎靜脈部分阻斷4周后可造成生殖系統氧化應激損傷：睪丸組織內丙二醛水平增加，GPx、SOD活性明顯降低，一氧化氮水平明顯增加；病理檢查發現睪丸生精損傷，血清ROS升高[23]。氧化應激可能通過破壞血-睪屏障而造成生殖系統損傷[24]。

血管阻斷時間決定氧化應激造模的成敗。對維斯塔大鼠右腎實施靜脈部分阻斷術30 d后，采用光澤精探針化學發光法檢測發現，右側睪丸內ROS明顯升高，細胞凋亡指數明顯增加[25]。使用睪丸動脈和腎靜脈夾閉法造成睪丸局部短期缺血(夾閉1 h后恢復血供24 h)，睪丸內精子受損但并不形成氧化應激[26]。

9脊髓損傷

Padron等[27]在人體發現，脊髓損傷可導致精液氧化應激損傷。Wang等[28]對SD大鼠進行脊髓損傷造模并檢測發現，大鼠精液濃度及活力下降，精液中的白細胞和畸形精子增多，認為精液質量下降系氧化應激所致。

10檳榔果提取物

檳榔子的生物堿成分——檳榔堿具有生殖毒性。以檳榔果提取物的水溶液連續灌胃(100 mg/kg)45 d可造成大鼠睪丸、附睪內丙二醛水平升高，CAT活性增強，過氧化氫清除劑——唾液酸水平降低，精子數量及活力降低，畸形精子率增加[29]。

11鈣離子通道阻滯劑

12手機輻射暴露

移動手機是現代生活必不可少的，先前的研究發現，高頻輻射暴露可導致精子數量和活力降低，細胞凋亡增加[31]，而導致這些改變的原因可能與高頻輻射引起生殖系統內氧化應激損傷有關。

雄性維斯塔鼠手機輻射暴露0.9 W/kg，2 h/d，連續45 d，即發現睪丸、附睪內發生氧化應激損傷：睪丸內胱天蛋白酶3活性明顯增加，蛋白激酶C明顯下降，精子總數和細胞凋亡明顯增加，脂質過氧化、過氧化氫酶活性增加，GSH、GPx水平降低[32-33]。

13年齡

隨年齡的增長，線粒體呼吸鏈功能不全，氧自由基增多[34]，抗氧化酶水平下降[35]，從而形成氧化應激。老年棕色挪威大鼠精液的抗氧化酶GPx、SOD活性降低，GR活性輕度增加[36]。老齡維斯塔大鼠精液中脂質過氧化增多，HO-、H2O2產生增加，抗氧化酶與非酶抗氧化物水平均降低，精子活力明顯下降[37]，證明老年大鼠生殖系統內發生氧化應激損傷，導致生殖系統功能下降。

14結語

不育癥是臨床男科常見的疾病之一，男性精液異常是導致男性不育癥的主要原因，而精神靜脈曲張、附性腺感染、免疫性因素、睪丸下降不全、梗阻性因素、創傷以及先天性疾病等均可導致精液異常。近年來，氧化應激被公認為造成男性不育的主要原因之一，其從微觀角度詮釋了精子質量的損害。影響精液氧化應激的因素非常廣泛，Lavranos等[38]對現階段發現的損害因素進行了歸納，包括物理源：放射、高溫；化學源：藥物、毒素、吸煙及重金屬；生物源：糖尿病、感染等，并從病理生理學角度認為ROS是引起人體各個系統多種疾病發生的重要原因：從生殖系統不育癥到神經系統，甚至引起人體衰老等。目前，氧化應激學說仍處于發展階段，尚未完全完善，其中仍存在不少爭議，尤其是在抗氧化應激治療方面。因此，氧化應激仍需進一步研究探索。

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摘要：氧化應激損傷通過影響精子濃度、降低精子活力、破壞精子DNA完整性、改變精子形態、加速精子凋亡等途徑影響精液質量，最終導致男性不育。近年來，生殖系統的氧化應激損傷受到男科醫師的廣泛關注。為闡明氧化應激損傷對生殖系統損傷的作用機制，研究人員已開展了大量的臨床及動物實驗研究。該文總結近年來研究生殖系統氧化應激損傷所用到的動物實驗方法，以期為以后的男性不育癥研究提供參考。

關鍵詞：男性不育癥；氧化應激；活性氧類；動物實驗

Advances of Animal Experimental Methods of Oxidative Stress in Reproductive SystemLITang-lin,WENGZhi-wei,ZHOUShao-hu.(DepartmentofReproductiveMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510405,China)

Abstract：Oxidative stress(OS) influences the quality of semen by decreasing sperm concentration, reducing motility of sperm,changing spermatozoa forms and accelerating spermatozoa apoptosis,finally leading to infertility.In recent years,OS in the reproductive system has been highly concerned.In order to explore the mechanism of OS damage of reproduction system,a lot of clinical and animal experiments have been developed.Here is to summarize the animal experimental methods in the research of OS in reproductive system in recent years,so as to provide a reference for the subsequent studies of male infertility.

Key words：Male infertility; Oxidative stress; Reactive oxygen species; Animal experiment

收稿日期：2014-03-20修回日期：2014-08-08編輯：辛欣

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.06.012

中圖分類號：R339.2

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)06-0991-04