ACE-siRNA對人臍靜脈內皮細胞MMP-9/TIMP-1及ET-1/NO表達的影響

楊 勇，曹 政，佟新竹，羅 濤，謝華強，吳瑞霞

內皮細胞在動脈粥樣硬化危險因素作用下，血管收縮因子內皮素-1(ET-1)釋放增加，舒張血管物質一氧化氮(NO)釋放減少，作用于血管基底膜的平滑肌細胞、內皮細胞，促進斑塊內血管新生、纖維膜溶解［1］。基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases，MMP-9)是影響粥樣斑塊穩定性的主要基質蛋白酶，與金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)平衡紊亂后，可導致斑塊纖維帽變薄，動脈粥樣硬化斑塊破裂［2］。多項研究使用小分子干擾RNA(siRNA)作用于動脈粥樣硬化的多個靶點，觀察其對動脈粥樣硬化的發生和進程均有顯著影響［3-4］。我們以往的研究利用脂質體轉染法將血管緊張素轉化酶(ACE)-siRNA轉染入人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)株CRL-1730，證實其能夠特異性的沉默內皮細胞ACE表達，也觀察到ACE-siRNA可調節ET-1表達［5］。但前期研究以內皮細胞株為研究對象，不清楚其對于原代內皮細胞是否有相同作用，也未闡明 ACE-siRNA對內皮細胞 MMP-9與TMIP-1表達的影響。本研究以體外培養HUVECs為研究對象，將ACE-siRNA轉染入細胞，驗證其對ACE mRNA和蛋白表達的沉默效應，觀察其對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導刺激的內皮細胞 MMP-9/TMIP-1、ET-1/NO表達的影響，探討ACE-siRNA作為動脈粥樣硬化斑塊干預治療的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料 LipofectamineTM2000、Trizol試劑(Invitrogen，USA);逆轉錄試劑盒(Fermentas，Lithuania);AngⅡ(Sigma，USA)。兔抗MMP-9多克隆抗體(Santa Cruz，USA);兔抗TIMP-1多克隆抗體(Bioworld Technology，USA);HRP標記的羊抗兔IgG抗體(Pierce，USA)。特異性沉默人ACE mRNA(Genbank，編號:NM_000789.2)的siRNA(廣州市銳博生物科技有限公司合成)，作用靶序列為5＇-GCATCACCAAGGAGAACTA-3＇。

1.2 HUVECs培養、轉染 按照我們以往發表的文獻中培養原代HUVECs的方法［6］，37℃培養箱內培養原代 HUVECs，傳代后用含 10%胎牛血清的DMEM調節密度至108/L種細胞于6孔板中。培養48 h至細胞融合30% ～50%后，換無血清培養液并使用脂質體2000轉染siRNA進入細胞。藍色激光激發FAM熒光，拍攝熒光圖片。于轉染后24和48 h提取細胞總RNA和總蛋白，檢測ACE mRNA及蛋白表達驗證沉默效率。

1.3 實驗分組及方法 實驗分為正常對照組，不加任何藥物;AngⅡ組，加入AngⅡ作用24 h，終濃度為1×10-7mmol/L，不進行轉染;AngⅡ刺激聯合ACE-siRNA轉染組(AngⅡ +siRNA組)，轉染入 ACE-siRNA 80 nmol/L并加入AngⅡ作用24 h，終濃度為1×10-7mmol/L。轉染siRNA的心肌細胞在轉染后24 h加入10-7mmol/L AngⅡ，繼續作用至轉染后48 h用于后續檢測。每孔重復3孔。

1.4 反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測ACE、MMP-9、TIMP-1 mRNA表達 Trizol法提取細胞總RNA，取1μg按照試劑盒說明書合成cDNA并作為模板行PCR擴增。ACE引物序列:上游5＇-CCCTCTACCTGAACCTCCA-3 ＇， 下 游 5 ＇-GACCTTCCCAGAACTCG-3＇，擴增片段 292 bp。MMP-9 引物序列:上 游 5 ＇-TACCAGCTACTCGGGAGG-3 ＇，下 游 5 ＇-GCATCGGGCAGGGTCTAT-3 ＇，擴 增 片 段 220 bp。TIMP-1 引物序列:上游 5＇-CCAGAAATCAACGAGACCACC-3＇，下游 5＇-TACGCCAGGGAACCAAGAAG-3＇，擴增片段 241 bp。GAPDH引物序列:上游 5＇-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3 ＇，下 游 5 ＇-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3＇，擴增片段 496 bp。以GAPDH為內參，PCR反應條件為94℃ 3 min，94℃30 s，解鏈溫度 30 s，72℃ 1 min，循環 30 次，最后72℃ 延伸10 min。循環35次，ACE、MMP-9、TIMP-1、GAPDH 退火溫度分別為 56、53、56、58℃。產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統攝像分析。用ACE、MMP-9、TIMP-1的條帶灰度值與GAPDH的條帶灰度值的比值代表 ACE、MMP-9、TIMP-1的相對含量。

1.5 蛋白免疫印跡(Western blot)法測定 ACE、MMP-9、TIMP-1蛋白表達 RIPA細胞裂解液提取各組細胞總蛋白。按照產品說明書完成Western blot操作。根據Marker判斷顯像蛋白大小。

1.6 用硝酸還原酶法進行NO濃度測定 NO在體內代謝很快轉為NO2-、NO3-，NO2-進一步轉化為NO3-。用硝酸還原酶特異性將 NO3-還原為NO2-，550 nm波長測樣品吸收值。NO(μmol/L)=(樣品管吸光度 -空白管吸光度)/(標準管吸光度-空白管吸光度)×100×樣品稀釋倍數。

1.7 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定ET-1濃度凍存標本復溶并置于冰浴中，按照產品說明書步驟完成一抗、二抗孵育及生物素反應、顯色操作，用酶標儀在450 nm波長處，以空白對照孔調零后測各孔光密度(OD)值;Excel軟件繪制散點圖計算標準曲線，根據各孔OD值計算樣品濃度。

1.8 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件包對數據進行分析，計量資料采用均數±標準差(x±s)表示，組內比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 原代培養的HUVECs 傳代培養24 h后，倒置顯微鏡(10×10)觀察可見細胞形態呈現梭形或鋪路石樣鑲嵌排列，細胞為扁平多角形，邊界清楚。見圖1。

2.2 細胞轉染與轉染后24、48 h ACE mRNA和蛋白表達 轉染24 h后，在激光共聚焦顯微鏡的藍光激發狀態下，可見綠色熒光在視野下成簇分布;與同一視野下明場細胞照片融合后發現綠色熒光主要分布在細胞胞漿中，證實siRNA成功轉染入細胞內。見圖2。與轉染前比較，ACE siRNA轉染后24 h ACE mRNA和蛋白的表達無明顯下降(P＞0.05)，轉染后48 h ACE mRNA和蛋白的表達均下調(P＜0.05)，mRNA下調比例達到52.5%，蛋白下調比例達51%，見表1、圖3。

圖1 原代培養的人臍靜脈內皮細胞顯微鏡下形態(10×10)圖2 轉染后人臍靜脈內皮細胞熒光顯微鏡下形態(40×10)A.常規視野;B熒光激發;C.A和B融合

表1 ACE-siRNA轉染前后ACE mRNA和蛋白表達(x ± s，n=3)

2.3 MMP-9、TIMP-1 mRNA和蛋白表達 AngⅡ組MMP-9 mRNA和蛋白表達較正常對照組明顯增加，AngⅡ+siRNA組MMP-9 mRNA和蛋白表達較AngⅡ組明顯下降(P＜0.05);3組TIMP-1 mRNA和蛋白表達比較差異均無統計學意義(P＞0.05);MMP-9/TIMP-1 mRNA和蛋白表達的比例AngⅡ組顯著高于對照組，AngⅡ+siRNA組顯著低于AngⅡ 組(P ＜0.05)。見表2，圖4～5。

2.4 ET-1和NO表達 與正常對照組比較，AngⅡ組ET-1表達明顯增加，NO表達減少(P＜0.05);與AngⅡ組比較，AngⅡ+siRNA組ET-1表達下調，NO表達增加(P＜0.05)。見表3。

圖3 ACE-siRNA對ACE mRNA及蛋白表達影響ACE為血管緊張素轉化酶;A.ACE-siRNA;B.ACE蛋白

表2 3組人臍靜脈內皮細胞MMP-9、TIMP-1 mRNA及蛋白表達及其比值(x ± s，n=3)

圖4 3組人臍靜脈內皮細胞基質金屬蛋白酶-9 mRNA和蛋白表達比較MMP-9為基質金屬蛋白酶-9;AngⅡ為血管緊張素-2;A.MMP-9 mRNA;B.MMP-9蛋白

圖5 3組人臍靜脈內皮細胞金屬蛋白酶組織抑制劑-1 mRNA和蛋白表達比較TIMP-1為金屬蛋白酶組織抑制劑-1，AngⅡ為血管緊張素-2;A.TIMP-1 mRNA;B.TIMP-1

表3 3組人臍靜脈內皮細胞一氧化氮、血管收縮因子內皮素-1的表達(x ± s，n=3)

注:AngⅡ為血管緊張素2;與正常對照組比較，aP＜0.05;與AngⅡ組比較，cP＜0.05

3 討論

血管緊張素轉換酶是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)的關鍵酶，是冠狀動脈粥樣硬化的重要治療靶點［7］。RNA干擾是基因沉默技術的常用手段［8］。本研究發現，在 AngⅡ作用下，HUVECs MMP-9表達增加，MMP-9/TIMP-1比例增高;同時ET-1表達增加，NO表達下調。而利用脂質體轉染方法將ACE-siRNA轉染入HUVECs，能夠在轉染后48 h下調ACE基因及蛋白水平的表達，沉默效率＞50%。同時觀察到HUVECs MMP-9表達明顯減少，MMP-9/TIMP-1比例下降;NO表達增加，ET-1表達顯著下調。提示ACE-siRNA可通過沉默ACE表達影響HUVECs ET-1、NO的表達，調整AngⅡ誘導下的HUVECs MMP-9/TIMP-1比例失衡。這一結果與Kojima等［9］的研究結果相似。其原因涉及 RAAS系統多個調控途徑，研究已證實Ang1-7肽主要由AngⅡ經ACE2分解產生，其可激活內皮細胞表面Mas受體;Ang1-7肽最終由ACE水解成無活性的肽分子［10］。Zhong等［11］發現隨著 ACE 表達下調，AngⅡ表達明顯增加，可促進AngⅡ向Ang1-7肽轉化;而Ang1-7肽與內皮細胞表面Mass受體結合可降低炎性相關核轉錄因子(NF-κB)活性，且Ang1-7肽濃度增加后也可促進緩激肽生成［12］，從而促進內皮細胞釋放NO，抑制ET-1釋放，發揮改善內皮功能作用［13］。隨著ACE沉默，ACE對緩激肽的降解減少，緩激肽通過緩激肽B1型受體系統及促進內皮細胞釋放NO參與內皮細胞功能調節［14］。MMP-9以Zn2+為輔助因子，包括NF-κB和SP1結合位點，隨著NF-κB下調，MMP-9 mRNA和蛋白合成和釋放均下調，進而調節 MMP-9/TIMP-1 比例［15-17］。

因此，ACE-siRNA作為HUVECs內ACE的特異性沉默工具，可有效沉默原代HUVECs ACE表達，調節MMP-9/TIMP-1表達和ET-1/NO表達，發揮調節內皮功能及改善動脈粥樣硬化斑塊穩定性的作用，可作為動脈粥樣硬化的治療靶點進一步研究。

［1］ Madden JA.Role of the vascular endothelium and plaque in acute ischemic stroke［J］.Neurology，2012，79(13 Suppl 1):S58-S62.

［2］ Su W，Gao F，Lu J，et al.Levels of matrix metalloproteinasE-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 mRNAs in patients with primaryhypertension or hypertensioninduced atherosclerosis［J］.J Int Med Res，2012，40(3):986-994.

［3］ Johnson J L，Dwivedi A，Somerville M，et al.Matrix metalloproteinase(MMP)-3 activates MMP-9 mediated vascular smooth muscle cell migration and neointima formation in mice［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011，31(9):e35-e44.

［4］ Guo T，Wang J，Yang J，et al.Lentivirus-mediated RNA interference of chymase increases the plaque stability in atherosclerosis in vivo［J］.Exp Mol Pathol，2013，95(1):51-56.

［5］ 楊勇，王瑋，黃從新，等.ACE siRNA對人臍靜脈內皮細胞ET-1表達的影響［J］.鄖陽醫學院學報，2009，28(2):109-112，封 2.

［6］ 王燕，王君，龔堅，等.兩種人臍靜脈內皮細胞培養方法的比較［J］.中外醫學研究，2013(2):38-39.

［7］ Saha S A.Angiotensin-receptor blockers for the management of hypertension:new insights，new challenges［J］.South Med J，2010，103(7):599-600.

［8］ Bhindi R，Fahmy R G，Lowe H C，et al.Brothers in arms:DNA enzymes，short interfering RNA，and the emerging wave of small-molecule nucleic acid-based genE-silencing strategies［J］.Am J Pathol，2007，171(4):1079-1088.

［9］ Kojima C，Ino J，Ishii H，et al.MMP-9 inhibition by ACE inhibitor reduces oxidized LDL-mediated foam-cell formation［J］.J Atheroscler Thromb，2010，17(1):97-105.

［10］ Iwanami J，Mogi M，Tsukuda K，et al.Role of angiotensin-converting enzyme 2/angiotensin-(1-7)/Mas axis in the hypotensive effect of azilsartan［J］.Hypertens Res，2014，37(7):616-620.

［11］Zhong J，Basu R，Guo D，et al.Angiotensin-converting enzyme 2 suppresses pathological hypertrophy，myocardial fibrosis，and cardiac dysfunction［J］.Circulation，2010，122(7):717-728.

［12］Raffai G，Khang G，Vanhoutte P M.Angiotensin-(1-7)augments endothelium-dependent relaxations of porcine coronary arteries to bradykinin byinhibiting angiotensinconverting enzyme 1［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2014，63(5):453-460.

［13］ Gauthier K M，Cepura CJ，Campbell W B.ACE inhibition enhances bradykinin relaxations through nitric oxide and B1 receptor activation in bovinecoronary arteries［J］.Biol Chem，2013，394(9):1205-1212.

［14］ Dzau V J，Bernstein K，Celermajer D，et al.Pathophysiologic and therapeutic importance of tissue ACE:a consensus report［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2002，16(2):149-160.

［15］Podesser B K，Siwik D A，Eberli F R，et al.ET(A)-receptor blockade prevents matrix metalloproteinase activation late postmyocardial infarction in the rat［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2001，280(3):H984-H991.

［16］楊麗娟，游育紅，林志彬，等.靈芝多糖肽對人臍靜脈內皮細胞氧化損傷的保護作用［J］.中國藥理學通報，2010，26(5):657-660.

［17］周曦，易龍，金鑫，等.SIRT1/UCP2通路在白藜蘆醇抑制血管內皮細胞氧化應激損傷中的作用［J］.第三軍醫大學學報，2013，35(16):1671-1675.