結腸腺瘤性息肉病基因啟動子區甲基化狀態在乳腺癌演變過程中的作用

姜英翰，郝 巖，潘鑫燕，黎貴蕓，王 麗，陳 玥，楊舉倫

乳腺癌的發生、發展是一個多因素、多步驟的長期復雜的演變過程［1-4］。其中，抑癌基因的甲基化及其導致的表達沉默在乳腺癌的發生和演變過程中起重要作用。相關研究發現，P16［5］、RASSF1A［6］、NOEY2［7］、WWOX［8］、PALB2［9］、BRCA1、BRCA2 等抑癌基因均與乳腺癌相關。結腸腺瘤性息肉病(APC)基因是重要的抑癌基因，Esteller等［10］在結直腸癌、胃癌、食管癌、肝癌、胰腺癌等消化道腫瘤中均檢測到了APC基因啟動子區的高甲基化。Liu等［11］研究發現，APC基因啟動子1A區出現的高甲基化與乳腺癌存在一定的關聯性。但是，目前尚不清楚APC基因的甲基化是發生在細胞癌變以后還是在癌前病變的某一階段。我們以往的研究結果提示，APC基因啟動子區甲基化未參與乳腺癌的發生過程［12］。但是，該結果僅能反映該細胞模型中APC基因甲基化的狀態，不能反映其他細胞系及原發性乳腺癌組織的甲基化狀態。因此本實驗通過甲基化特異性PCR(MSP)檢測正常乳腺組織(NBT)、乳腺普通型導管增生(UDH)、非典型導管增生(ADH)、原位導管癌(DCIS)、浸潤性導管癌(IDC)中APC基因啟動子區甲基化狀態，并使用定量聚合酶鏈反應(QPCR)技術檢測APC基因的mRNA表達水平，觀察APC基因的甲基化狀態和基因表達在乳腺癌發生過程中的變化，探討APC基因甲基化和基因表達與乳腺癌發生的關系及其在乳腺癌早期診斷和治療中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源:收集成都軍區昆明總醫院2010—2012年手術切除的46例 IDC標本、27例UDH標本、17例癌旁NBT標本及存檔蠟塊中20例DCIS標本、13例ADH標本，均為女性，一般情況見表1。其中，IDC標本TNM分期:Ⅰ期10例，Ⅱ期28例，Ⅲ期8例;組織學分級:Ⅰ級15例，Ⅱ級24例，Ⅲ級7例;腋窩淋巴結轉移21例;人表皮生長因子受體-2(HER-2)陽性16例，雌激素受體(ER)陽性29例，孕激素受體(PR)陽性22例，DCIS樣本HER-2陽性2例，ER陽性11例，PR陽性9例。新鮮標本在手術切除后放于液氮中速凍，之后置于-80℃低溫冰箱中保存。石蠟標本均經10%中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋。上述標本均經病理醫師檢查驗證和歸類。

1.1.2 主要試劑:基因組DNA提取試劑盒、D2000 DNA marker、普通質粒小提試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;QIAamp DNA FFPE Tisuue Kit、EpiTect Bisulfite Kit均購自 QIAGEN公司;BamH I酶、Sal I酶購置Fermentas公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取:新鮮冰凍組織DNA提取按照天根公司DNA提取試劑盒說明書進行操作，石蠟組織基因組DNA提取按照QIAGEN公司QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒說明書進行操作。用紫外分光光度儀檢測提取DNA的含量和純度。

表1 5種乳腺切除標本患者臨床資料

1.2.2 MSP方法

1.2.2.1 DNA的亞硫酸氫鹽修飾:基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾采用QIAGEN公司的EpiTect Bisulfite Kit試劑盒，修飾后樣品于-20℃避光存儲。

1.2.2.2 MSP擴增:利用 MethyI Primer Express V1.0設計APC基因MSP引物，目的片段大小均為142 bp，甲基化引物序列:MF 為5＇-TGTTTTATTGCGGAGTGC-3＇，MR 為 5＇-ACAACCACATATCGATCACG-3＇。未甲基化引物序列:UF 為 5＇-TTGTGTTTTATTGTGGAGTGT-3 ＇，UR 為 5 ＇-ACAACCACATATCAATCACATAC-3＇。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。MSP反應中，以正常人外周血淋巴細胞基因組作為陰性對照，以人乳腺癌MDA-MB-231細胞基因組DNA作為陽性對照，以去離子水作為空白對照。PCR反應體系:去離子水4.75μl，2×GC緩沖液12.5 μl，dNTPs 2.5 μl，上下游引物各 2 μl，甲基化修飾后的DNA 1μl，DNA聚合酶0.25μl。PCR反應條件為:95℃預變性5 min，95℃變性40 s，67℃退火40 s，72℃延伸 40 s，25 個循環，72℃后延伸10 min。

1.2.2.3 結果判定:PCR產物用1%～2%瓊脂糖凝膠進行電泳觀察。若只擴增出甲基化產物，說明此樣本目的基因發生了完全甲基化;若只擴增出未甲基化產物，則此樣本目的基因未發生甲基化;若同時擴增出甲基化和未甲基化產物，說明此樣本發生部分甲基化。完全甲基化和部分甲基化均計為甲基化檢測陽性。

1.2.2.4 基因甲基化水平的積分光密度(IOD)判定:使用Quantity One軟件測定甲基化條帶(M)和未甲基化條帶(U)的IOD，通過計算IODM/(IODM+IODU)，判定APC基因的甲基化水平。

1.2.3 實時定量PCR檢測APC基因mRNA表達水平:Trizol提取總RNA，按照Fermentas cDNA第一鏈合成試劑盒操作合成cDNA第一鏈。APC基因引物序列:F 為 5＇-ATGATTGCTATGGGAAGT-3＇，R 為 5＇-TCTGTTGCTGGATGGT-3＇，產物大小 455 bp。內參基因GAPDH引物序列:F為5＇-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3＇，R 為 5＇-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3＇，產物大小108 bp。采用BIO-RAD CFX96TMReal-time System進行檢測。PCR反應體系:去離子水3μl，EvaGreen Supermix 7.5 μl，上下游引物 1 μl，模板cDNA 2.5μl。PCR反應條件為:95℃預變性3 min，95℃變性 10 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 20 s。結果使用2ΔΔct法計算APC基因的相對表達量，以NBT為對照，內參GAPDH做樣本內校正。

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行統計學處理。計量資料以中位數±四分位間距(M±Q)表示，應用秩和檢驗，計數資料以率(%)表示，應用χ2檢驗;相關性采用Spearman等級相關分析，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 APC基因啟動子甲基化狀態 用APC基因甲基化和未甲基化引物分別對17例NBT，27例UDH，13例ADH，20例DCIS，46例IDC標本中的DNA進行擴增，見圖1。NBT、UDH、ADH、DCIS及IDC 的甲基化率分別為 0、0、69.23%(9/13)、90.00%(18/20)及80.43%(37/46)。ADH、DCIS、IDC 甲基化率均高于NBT及UDH(P＜0.05)，但3種標本甲基化率比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 APC基因的甲基化水平 APC基因的甲基化水平IDC為0.557±0.306，ADH為0.070±0.147，DCIS為0.298±0.496，IDC APC基因的甲基化水平高于ADH和 DCIS(P＜0.05)，但 ADH和 DCIS比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.3 APCmRNA在IDC中的表達 分別抽取26例IDC、10例NBT樣本，比較APC mRNA表達量的差異，結果顯示IDC為0.120±0.131，NBT為1.161±0.312，IDC低于 NBT(P＜0.05)。

2.4 IDC中APC基因甲基化狀態與mRNA表達的關系 26例IDC中，APC mRNA的表達量未甲基化標本為 0.319±0.100，完全甲基化標本中為0.036±0.020，部分甲基化標本中為 0.071±0.070，未甲基化標本中的表達量高于完全甲基化和部分甲基化標本(P＜0.05)，但完全甲基化和部分甲基化標本間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。APC基因甲基化水平與其mRNA表達水平呈負相關關系(r=-0.469，P=0.016)。

2.5 APC基因啟動子區甲基化與IDC臨床病理參數的關系 APC基因甲基化狀態和水平均與患者年齡、腫瘤直徑、組織學分級、淋巴結轉移、TNM分期、HER-2、ER、PR 無關(P ＞0.05)，見表2。

圖1 5種乳腺組織標本結腸腺瘤性息肉病基因啟動子的甲基化狀態NBT為正常乳腺組織，UDH為乳腺普通型導管增生，ADH為非典型導管增生，DCIS為原位導管癌，IDC為浸潤性導管癌;Ma為D2000 Marker，從上到下依次為250 bp、100 bp;1～6:不同樣本編號;NC為陰性對照，PC為陽性對照，BC為空白對照;U為未甲基化引物，M為甲基化引物

3 討論

UDH、ADH、DCIS是 3 種乳腺癌前病變［13］。其進展為IDC的風險較正常人依次增加，研究這些癌前病變的分子遺傳學和表觀遺傳學變化對于探討乳腺癌發生的分子機制及早期診斷具有重要意義。乳腺癌的發生發展與基因的遺傳學改變和表觀遺傳學改變有關。表觀遺傳學改變是指基因表達水平發生變化而DNA序列未發生變化的可遺傳性改變，包括DNA甲基化、組蛋白修飾與染色體重塑。研究證實，DNA甲基化是表觀遺傳學改變的主要形式。其中，抑癌基因異常高甲基化在細胞發生惡性轉化的過程中發揮重要作用。APC基因是重要的抑癌基因，其功能主要是通過參與Wnt信號途徑，影響細胞分裂、黏合和遷移等。APC基因異常可導致在胞質內聚集的β-catenin轉位到細胞核內，激活細胞增殖相關基因，引起Wnt信號通路異常，導致腫瘤的發生與發展［14-15］。

表2 APC基因啟動子區甲基化狀態及水平與乳腺浸潤性導管癌臨床病理參數的關系

Lee等［16］在乳腺癌患者乳頭抽取液提取的DNA中發現APC基因的高甲基化。Jin等［17］也在原發性乳腺癌組織中發現APC基因啟動子區CpG島高甲基化，這些證據提示APC基因的異常甲基化與乳腺癌的發生密切相關。但是上述研究都局限于用乳腺組織作為研究對象，缺乏癌前病變的資料，結果只能說明APC基因的異常甲基化可能與乳腺癌有關，對于乳腺組織從UDH發展到IDC整個過程中，APC基因的甲基化狀態尚不清楚。為此，本實驗將UDH、ADH、DCIS及IDC納入研究對象，研究APC基因的甲基化狀態在乳腺癌發生、發展中的作用。

本研究結果顯示，APC基因在 NBT、UDH、ADH、DCIS及IDC乳腺組織中的甲基化率分別為0、0、69.23%、90.00%及80.43%。隨著病變程度的增加，ADH、DCIS與IDC甲基化率高于 NBT與UDH，但ADH、DCIS與IDC甲基化率比較差異無統計學意義。為此，我們利用Quantity One軟件從甲基化水平進行分析，發現IDC組的甲基化水平高于ADH組與DCIS組，即IDC組甲基化DNA拷貝數占總DNA拷貝數的比例明顯高于ADH、DCIS組。結合兩方面的結果進行分析，我們發現在乳腺導管上皮細胞癌變的過程中，APC基因啟動子區的甲基化程度是逐漸增高的。其中，IDC樣本的甲基化程度最高，DCIS和ADH次之，UDH和NBT最低。Hoque等［18］研究發現，APC、CTNNB1 與 CDH1 基因的甲基化率和水平IDC標本高于NBT標本。Park等［19］研究發現，APC、DLEC1、HOXA1 和 RASSF1A 4 種基因啟動區CpG島的甲基化率和水平在ADH中高于NBT。本研究結果發現，在乳腺癌發生過程中APC基因的甲基化程度隨著病變程度的加重而升高，與報道一致。提示APC基因的異常甲基化狀態可能對乳腺癌的發生起到了促進作用，通過檢測APC基因的甲基化狀態可以預測乳腺癌的發生風險。

本研究發現，甲基化標本(包括部分甲基化和完全甲基化)的APC mRNA表達水平明顯低于未甲基化標本，且26例IDC中APC基因的甲基化水平和其mRNA表達量呈負相關關系，說明乳腺癌發生過程中APC基因啟動子的異常甲基化是導致其表達失活的重要原因之一，與 Liu等［11］報道結果相符。但如果將甲基化標本分為部分甲基化和完全甲基化，則兩組間mRNA表達量無統計學差異，原因可能是MSP結果只能反映出引物結合部位的CpG位點的甲基化情況。

綜上所述，在乳腺癌中除啟動子區CpG島甲基化以外，可能還有其他機制導致了APC基因的轉錄沉默及蛋白表達障礙。因此，對于APC基因失活導致乳腺癌發生的機制，有必要從不同角度進行進一步研究。

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