低氧誘導因子-1α在聲門上型喉癌中的表達及其對頸淋巴結轉移的影響

李曉明，宋 琦，路秀英，邸 斌

淋巴結轉移是影響頭頸腫瘤預后的獨立危險因素。聲門上型喉癌發病隱匿，生長速度快，侵襲性強，早期即可發生頸淋巴結轉移。已有大量臨床病理學研究對頸淋巴結轉移方式和規律進行了探討，但聲門上型喉癌頸淋巴結轉移機制仍需進一步深入研究。已有研究證實，低氧誘導因子-1α(HIF-1α)在多種腫瘤細胞中呈過度表達狀態［1-6］，并對腫瘤臨床生物學行為和預后產生影響，認為組織的相對低氧環境是造成腫瘤發展、侵襲和轉移及治療抵抗的重要因素。其主要原因是低氧能使腫瘤細胞的一些基因和蛋白的合成或表達增加［7-11］，而在這個過程中HIF-1α起中樞紐帶作用。目前，HIF-1α及其相關調控因子在聲門上型喉癌中表達對腫瘤頸淋巴結轉移的影響尚不清楚，本文對此進行了深入研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇解放軍白求恩國際和平醫院2006年1月—2010年12月手術治療的聲門上型喉癌63例標本，男59例，女4例;年齡43～72歲，中位年齡56歲。根據國際抗癌協會(UICC)標準(1997)確定的TNM分期:Ⅰ期8例，Ⅱ期11例，Ⅲ期14例，Ⅳ期30例;病理學分級:鱗癌Ⅰ級15例，鱗癌Ⅱ級29例，鱗癌Ⅲ級19例。所有患者接受了不同方式的喉癌切除及頸淋巴結清掃術。術后病理證實頸部淋巴結轉移41例，無轉移22例。切除手術標本一部分迅速置于液氮罐中保存，另一部分標本離體后2 h內放入10%中性福爾馬林中固定24 h石蠟包埋，常規病理HE染色，所有標本均經2位副高以上職稱的病理科醫生確定病理性質和病理學分級，腫瘤組織均經病理證實為鱗狀細胞癌，取63例中經病理證實為正常喉黏膜組織的癌旁組織(腫瘤與正常組織邊界以外至少0.5 cm)20例作為對照。

1.2 主要試劑 一抗:鼠抗人HIF-1α和鼠抗人血管內皮生長因子(VEFG)-C單克隆抗體購自武漢博士德生物工程公司，工作濃度為1∶100;鼠抗人VEGF單克隆抗體:福州邁新生物技術公司，工作濃度為1∶75。鼠抗人VEGF-C、CD34單克隆抗體和羊抗人LYVE-1(LYVE-1 E-20:sc-19316)多克隆抗體，購自Santa Cruz公司;SP-9002試劑盒購自北京中山生物技術公司。

1.3 流式細胞儀檢測HIF-1α、VEGF、VEGF-C蛋白表達 為了避免非腫瘤細胞的污染，對石蠟標本行10μm厚切片，每個標本共5張切片，簡單HE染色后在顯微鏡下選擇性對腫瘤細胞進行機械微切割［8］，將從5張切片獲取的腫瘤細胞集中后采用網搓法制備單細胞樣品。取1×106/ml細胞懸液用PBS液洗滌2次，加一抗工作液0.1 ml(分別為HIF-1α、VEGF、VEGF-C 蛋白單克隆抗體)，室溫孵育30 min，PBS洗滌1次。加羊抗鼠FITC-IgG二抗100 μl，避光室溫孵育 30 min。加 PBS 10 ml，離心后加PBS0.1 ml，500目銅網過濾后上機檢測。在對蛋白免疫熒光標記物測定時，設一抗或二抗的本底對照和陰性對照。采用美國Beckman Coulter公司生產的Epics-XLⅡ型流式細胞儀進行檢測。激發光源為15 mW的氬離子激光器，激發波長為488 nm，應用Expo 32 ADC進行免疫熒光數據分析。檢測前用flow-checkTMFluorpheres(10μm)熒光微球(REF 6605359.Beckman Coulter，Inc.Fullerton，CA 92835)作為標準樣品，調整儀器的變異系數值在2%以內。以熒光指數(FI)表示蛋白表達產物的相對含量，FI=瘤細胞表達的平均熒光強度/正常對照樣品平均熒光強度。FI可相對客觀的反映蛋白的表達程度，FI值越大，表達量越高。

1.4 反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測HIF-1α

1.4.1 總RNA提取:Trizol試劑法提取總RNA(按說明書方法步驟進行)，具體步驟為:取50～100 mg液氮保存的組織，加冰預冷的變性液，在組織勻漿器中迅速勻漿15～30 s。加70μl 2 mol乙酸鈉(pH 4.0)，充分混勻。加700μl酚:氯仿:異戊醇(25∶24∶1)充分混勻，冰上15 min。10 000 g 4℃離心20 min，取上層水相。加等量異丙醇，-20℃至少30 min。10 000 g 4℃離心15 min，沉淀用500μl變性液懸起。加500μl預冷異丙醇，-20℃至少30 min。10 000 g 4℃離心15 min，棄上清，加75%乙醇洗1次，真空干燥10～20 min。用無水RNase溶解，-70℃保存。

1.4.2 逆轉錄反應體系和條件:DNTP 2μl，10×PCR buffer 2 μl，MgCl22 μl，Rnase抑制劑 0.5 μl，AMV 1 μl，OligdT 1 μl，適量 RNA 樣品，用 ddH2O補足至20 μl。50℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min。PCR擴增:取4μl逆轉錄產物，加 MgCl23μl、10×PCR buffer 2 μl、引物各 2 μl，Tag 酶 0.5 μl，用ddH2O補足至 50μl。擴增條件為 95℃預變性5 min，94℃ 變性 45 s，62℃ 退火 45 s，72℃ 延伸1 min，30個循環后，于72℃延伸10 min。以β-actin為內參照。HIF-1α引物序列:上游引物為GTCGGACAGCCTCACCAAACAGAGC(s)，下游引物為GTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAG(as)，擴增片段長度為487 bp。PCR產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相，做定量分析。以目的產物量/β-actin產物量的比值表示最終結果。

1.5 免疫組化染色檢測 HIF-1ɑ、VEGF、VEGF-C、CD34和LYVE-1蛋白表達特點及微血管密度(MVD)和淋巴管密度(LVD)計數 標本染色步驟為:石蠟切片，每張切片厚5μm，常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水化。經消除內源性過氧化物酶活性和抗原修復處理后，滴加正常山羊血清室溫孵育10 min，滴加一抗(抗 HIF-1ɑ、VEGF、VEGF-C、CD34和 LYVE-1抗體)，4℃過夜。用 PBS緩沖液洗5 min×3次，滴加生物素標記山羊抗兔IgG，室溫孵育15 min。用PBS洗5 min×3次，滴加辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液室溫孵育15 min，用PBS洗5 min×3次，DAB鏡下控制顯色。自來水充分沖洗后，用蘇木精復染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為標本染色的陰性對照。

1.6 腫瘤組織MVD和LVD的計算方法 在臨床及病理特征未知的情況下，低倍鏡下選擇要觀察的區域，MVD計數時主要觀察腫瘤邊緣或間質區域，LVD計數時需分別觀察腫瘤實質和間質區域。在選擇區域內200倍視野下隨機記錄5個視野的微脈管數，求其平均值作為腫瘤MVD數和LVD數。

1.7 統計學方法 應用SAS 8.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差(x±s)表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，計數資料以率(%)表示，采用χ2檢驗及Fisher精確檢驗，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 HIF-1ɑ、VEGF、VEGF-C表達病理特點 3種蛋白在聲門上型喉癌細胞中均有不同程度的表達，其特點為HIF-1ɑ主要表達于細胞質，部分表達于細胞核，呈棕黃色染色;VEGF主要表達在細胞質，著色為密度較高的棕黃色，在角化的癌巢表達更明顯;VEGF-C染色為深棕色顆粒樣，主要表達于細胞質，部分表達于細胞核，見圖1。

圖1 HIF-1ɑ、VEGF和VEGF-C在聲門上型喉癌和癌旁正常組織中表達(ABC×200)HIF-1ɑ:低氧誘導因子-1ɑ;VEGF血管內皮生長因子;A.HIF-1ɑ染色陽性;B.VEGF染色陽性;C.VEGF-C染色陽性;D癌旁正常黏膜

2.2 HIF-1α、VEGF和VEGF-C在聲門上型喉癌中的表達量 腫瘤組織和癌旁正常喉黏膜組織內均有HIF-1αmRNA表達，但表達量方面比較無明顯差異，見圖2。HIF-1α、VEGF和 VEGF-C在頸淋巴結轉移灶中的表達量高于原發灶，有頸淋巴結轉移者中的表達量高于無淋巴結轉移者(P＜0.05，P＜0.01)，見表1。

圖2 低氧誘導因子-1αmRNA在正常喉黏膜和聲門上型喉癌組織中表達

2.3 HIF-1α的表達與VEGF、VEGF-C的關系 經Pearson相關檢驗分析，HIF-1α與VEGF、VEGF-C在腫瘤組織和轉移灶中的表達均呈正相關(r=0.799，r=0.789，P ＜0.05;r=0.686，r=0.823，P ＜0.05)。

表1 HIF-1α、VEGF和VEGF-C表達熒光指數與聲門上型喉癌臨床病理參數的關系(x±s)

2.4 CD34和LYVE-1表達 CD34蛋白主要表達于腫瘤間質的微血管內皮細胞上，LYVE-1表達于腫瘤實質和間質內的微淋巴管內皮細胞上。對照組喉黏膜CD34著色脈管主要分布于上皮下層。CD34陽性表達的一些管狀結構，管道管壁較厚，形狀規則，呈圓形或橢圓形，內皮細胞核扁平，管腔內常可見大量紅細胞。符合毛細血管的形態學特征。CD34染色陽性脈管主要分布在腫瘤邊緣和間質區域。LYVE-1著色脈管主要分布于上皮下層，LYVE-1陽性表達的管狀結構中內皮細胞呈褐色，這些管道管壁比較薄，并且不規則，管腔大，通常呈塌陷狀，內皮細胞核大，且向腔內突出，符合毛細淋巴管的典型形態學特征。淋巴管腔內有時可見大量絮狀物質、淋巴細胞、腫瘤細胞及其碎片。毛細淋巴管主要分布在腫瘤組織與正常組織交界處，腫瘤中心處的實質內有少量淋巴管。見圖3。

圖3 聲門上型喉癌組織中的微血管和微淋巴管(ABC×200)A.CD34染色陽性的微血管;B.LYVE-1染色陽性的微淋巴管

2.5 MVD和LVD計數 頸淋巴結轉移的41例中，MVD和 LVD分別為35.60±6.54和28.70±7.18;在未發生頸淋巴結轉移的22例中，MVD和LVD分別為11.80±3.36和8.90±3.12。頸淋巴結轉移者MVD和LVD計數均高于無頸淋巴結轉移者(P＜0.05)。

3 討論

HIF-1是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內的一種轉錄因子，能激活許多缺氧反應性基因的表達，是哺乳動物和人在缺氧條件下維持氧穩態的關鍵性物質［12］。已經發現，人類多數腫瘤組織中都有顯著的缺氧區域，處于缺氧狀態的腫瘤細胞仍能不斷增殖、浸潤，在此過程中HIF-1起著十分重要的作用［13］。在 HIF-1的亞型中，HIF-1α有一個氧依賴降解區(ODD)，當局部氧的濃度＞5%時，通過激活泛素蛋白酶體途徑，作用于HIF-1αODD區，使其迅速降解，半衰期＜5 min［14］，因此在供氧正常的組織內很難被檢測到。缺氧條件下，泛素蛋白酶對HIF-1α的降解作用受阻，引起細胞質內HIF-1α積聚增多［15］。我們的研究發現，HIF-1α蛋白在聲門上型喉癌的細胞中大量表達，而在癌旁正常組織細胞中幾乎檢測不到。提示喉癌的腫瘤區域存在著低氧并由此誘發HIF-1α介導的低氧反應，但腫瘤細胞內的HIF-1αmRNA水平卻無變化。Kallioa等［16］在體外研究中發現，低氧時HIF-1αmRNA的表達較常氧時并不增加，但是蛋白表達明顯增多。因此認為，低氧下HIF-1α合成的調節并不在mRNA表達水平，而在轉錄和翻譯后追平。本研究結果充分證明這一現象也存在于人喉癌組織中。

HIF-1α作用是通過其調節下游的各種靶基因來實現的，其中主要的基因之一就是VEGF，包括多種亞型，已有研究證實這些細胞因子可以調解和影響腫瘤微血管和微淋巴管生成［17］。本研究結果顯示，聲門上型喉癌中HIF-1α蛋白表達與VEGF和VEGF-C表達呈正相關。進一步研究結果顯示，聲門上型喉癌中MVD和LVD數量與腫瘤發生頸淋巴結轉移有關。由此推測，HIF-1α可能對腫瘤微血管和微淋巴管生成具有促進作用，并可通過調節腫瘤微血管和微淋巴管生成促進頸淋巴結轉移。本研究結果還顯示，腫瘤轉移灶中HIF-1α、VEGF、VEGF-C表達水平較原發灶升高。表明HIF-1α高表達及其對相關蛋白的調節在腫瘤轉移灶形成過程中具有重要作用，但其確切機制還有待于進一步研究。

腫瘤新生血管是腫瘤生長、局部浸潤和向鄰近組織侵襲的必要條件，是腫瘤發生轉移的促生條件。MVD越高其促生轉移的概率就越高，發生轉移的可能性就越大，這一現象已經得到證實［11］。腫瘤發生轉移的另一個必要條件是腫瘤新生淋巴管的存在，腫瘤侵入局部微淋巴管是腫瘤發生淋巴結轉移的病理解剖基礎。近年腫瘤微淋巴管形成與腫瘤淋巴結轉移的關系越來越引起眾多學者的關注［17］。為了更加準確地闡明這一問題，人們不斷尋找鑒定淋巴管的各種標志性蛋白，這其中包括目前認為最特異的淋巴管標志物 LYVE-1［18-19］。本研究發現，在有頸淋巴結轉移的聲門上型喉癌者中，無論是腫瘤間質和實質中的LVD均較無頸淋巴結轉移者增高，表明腫瘤微淋巴管的生成對聲門上型喉癌頸淋巴結轉移的發生有明顯影響。但有關腫瘤實質和間質內微淋巴管在頸淋巴結轉移發生過程中哪一個更重要及兩者的相互關系還有待于進一步研究。

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